Bt伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用学习教案

1、会计学1Bt伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用第1页/共73页 Bacillus thuringiensis (Bt)Sporulated cultureCrystal第2页/共73页第3页/共73页苏云金芽胞杆菌能产生7种毒素蛋白-内毒素-外毒素-外毒素-外毒素不稳定外毒素水溶性毒素鼠因子外毒素CryCryCryCryCry-Cyt第4页/共73页第5页/共73页第6页/共73页第7页/共73页本实验室主要研究内容：第8页/共73页1.毒素蛋白的基本特征和分类毒素蛋白的基本特征第9页/共73页米粒状晶体 YBT-1518毒素蛋白的基本特征球形晶体B.thuringi

2、ensis M15菱形晶体第10页/共73页毒素蛋白的分类 第11页/共73页毒素蛋白的分类 第12页/共73页毒素蛋白的分类 第13页/共73页毒素蛋白在Bt中的分布 第14页/共73页2.毒素蛋白的结构和功能 第15页/共73页Cry5BaCry1Aa2.毒素蛋白的结构和功能 第16页/共73页 Swiss-PdbViewer显示Cry蛋白三维模型IIIIIIPymol显示Cry蛋白三维模型2.毒素蛋白的结构和功能 第17页/共73页Pymol预测蛋白质表面相对静电荷2.毒素蛋白的结构和功能 第18页/共73页Molsoft预测cry蛋白活性位点2.毒素蛋白的结构和功能 第19页/共73页

3、2.毒素蛋白的结构和功能 2.1 结构域：第20页/共73页2.1.1“铅笔刀”模型： 第21页/共73页伞状模型2.1.2 “伞状模型” ： 第22页/共73页2.1.3 “5螺旋六聚体”模型： 第23页/共73页 2.2 结构域： 第24页/共73页2.3 结构域： 第25页/共73页2.4 三个结构域之间的相互作用 第26页/共73页第27页/共73页3.毒素蛋白与昆虫的作用机理 毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 第28页/共73页毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 第29页/共73页毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 第30页/共73页第31页/共73页3.2 毒素蛋白受体： 第32

4、页/共73页3.2.1 APN(aminopeptidase N) 第33页/共73页3.2.1.1 APN受体结合的毒素种类 第34页/共73页3.2.1.2 APN受体对毒素插入质膜的介导 第35页/共73页昆虫中肠 APN受体与 Bt 杀虫毒力 第36页/共73页3.2.2 类钙粘蛋白(Cadherin-like) 第37页/共73页棉铃虫中肠类钙粘蛋白结构模型 3.2.2 类钙粘蛋白(Cadherin-like) 第38页/共73页碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase ，ALP ） 第39页/共73页3.2.4 其他的毒素受体 Glyco-conujgate recep

5、tor第40页/共73页毒素蛋白的应用 4.1 Bt在农业生产中的应用 第41页/共73页 Bt的主要产品剂型 蔬菜蔬菜-水剂，撒粉剂水剂，撒粉剂水稻水稻-油剂，粉剂油剂，粉剂林木林木-油剂，粉剂油剂，粉剂卫生卫生-漂浮粒剂漂浮粒剂4.1 Bt在农业生产中的应用 第42页/共73页Bt 的主要市场4.1 Bt在农业生产中的应用 第43页/共73页 主要防治对象小菜蛾小菜蛾菜青虫菜青虫棉铃虫棉铃虫玉米螟玉米螟稻稻 螟螟松毛虫松毛虫蚊子幼虫蚊子幼虫 4.1 Bt在农业生产中的应用 第44页/共73页4.1 Bt在农业生产中的应用 第45页/共73页4.2 Bt毒素在抗病方面的应用 第46页/共73

6、页白血病T细胞正常T细胞肝癌正常肝细胞4.2 Bt毒素在抗病方面的应用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Cell survival %Cell survival %第47页/共73页白血病T细胞宫颈癌细胞4.2 Bt毒素在抗病方面的应用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL 第48页/共73页4.

7、3 利用分子生物学技术定向进化毒素蛋白基因 第49页/共73页4.3.1 新的毒素基因的鉴定与克隆 4.3.1.1 Bt140菌株中cry2Ac6新基因的克隆： 第50页/共73页 中其他功能基因的扩增 第51页/共73页4.3.2. 利用生化和分子生物学技术定向改造毒蛋白 4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第52页/共73页4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第53页/共73页Cry蛋白中18- 19loop的结构与序列比对4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第54页/共73页Cry1Aa蛋白结构，18- 19loop及与其

8、相邻的残基4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第55页/共73页4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第56页/共73页Bt4基因组易错PCRCry1AcPCR回收TA克隆筛选PCR回收pET28aBL21表达毒素基因cry1Ac核心区改组文库通过易错PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第57页/共73页突变子的表达1、对照Cry-B(1Ac）2、突变子T524N 3、Cry-B阴性对照 M、Maeker通过易错PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第58页/共73页通过易错PCR和DNA shufflin

9、g定向改造毒蛋白，提高毒力 第59页/共73页16小时32小时对照vip3基因在Bt无晶体突变株XBU001中的表达4.3.3 工程菌构建 4.3.3.1 中vip基因的克隆表达及重组杀虫工程菌构建 第60页/共73页4.3.3.2 携带异源毒素基因的Bt工程菌的构建 pH5AXI（ hwtx-XI ）在菌株中的表达 1,Bt4.0718; 2-4, Bt4.0718(pH5AXI). 第61页/共73页采用EGFP抗体(A)和-ACTX 抗体(B)对Cry1Ac-ACTX-Hv1a-egfp融合蛋白的Western-blot检测 工程菌伴胞晶体的原子力显微镜检测A、Cry1-B(1Ac-AC

10、TX-EGFP) B、Cry1-B(1Ac）4.3.3.2 携带异源毒素基因的Bt工程菌的构建 第62页/共73页5.苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究 5.1 Bt杀虫晶体蛋白质组研究 第63页/共73页 A B C D（A）、Bt武汉亚种（B）、和以色列亚种H14(C)、伴胞晶体杀虫晶体蛋白的双向电泳及其与HD-1杀虫晶体蛋白的gel spot的匹配图谱(D)5.2 不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究 第64页/共73页菌株Bt4.0718菌株、Bt库斯塔克亚种HD-1Bt以色列亚种H14武汉亚种140斑点数1229126 1129025220105.2 不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研

11、究 第65页/共73页5.2 不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究 第66页/共73页5.3 Bt工程菌株杀虫晶体的蛋白质组学研究 A B Bt4（Phah43）（A）、XBU001(pHTAcS60)（B）晶体蛋白的双向电泳图第67页/共73页NoImage 对部分特征蛋白质点进行原位酶解、肽质量指纹图分析，鉴定到Bt菌株和转Bt菌株含有Cry1Aa，Cry1Ac等蛋白，还发现第四期芽胞蛋白A，翻译延伸因子-Tu，丙氨酸脱氢酶，丙酮酸脱氢酶E1复合物，亚单位，伴侣蛋白DnaK，ATP合成酶链，丙酮酸脱氢酶E3复合物等部分伴侣蛋白。如下表所示：5.3 Bt工程菌株杀虫晶体的蛋白质组学研究 第68页/共73页5.4