第十八章,基因组学与后基因组学

1、第十八章、基因组学 基因组：生物细胞中单套染色体的所含DNA序列的全部组成。 人类基因组：22条常染色体和X，Y染色体的DNA组成。 基因组大小 种类 Mb大肠杆菌 4.64啤酒酵母 12.1线 虫 100果 蝇 140蝗 虫 5000小 鼠 3300豌 豆 4800玉 米 5000小 麦 17000人 3000 分类最小基因组支原体 0.58 X 106细菌 2.8 X 106酵母 3.0 X 107霉菌 5.5 X 107蠕虫 1.1 X 108昆虫 0.5 X 109鸟类 0.2 X 1010两栖类 0.1 X 1010哺乳类 2.8 X 1010 DNA序列的分类基因序列和非基因序列

2、基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束的一段DNA序列，称为开放阅读框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。 单一序列和重复序列 单一序列： 基因组中只有一份的DNA序列。重复序列：基因组中重复出现的序列。例如，STR，SNP，微卫星DNA等。 什么是基因？什么是基因？ 基因在哪里？基因在哪里？寻找基因的思路：基因定位基因定位基因定位基因定位基因定位基因定位基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆基因克隆基因分离基因分离基因分离基因分离基因分

3、离基因分离将基因定位于染色体上将基因定位于染色体上将基因定位于染色体上将基因定位于染色体上将基因定位于染色体上将基因定位于染色体上有大到小，由粗到细，精细定位有大到小，由粗到细，精细定位有大到小，由粗到细，精细定位有大到小，由粗到细，精细定位有大到小，由粗到细，精细定位有大到小，由粗到细，精细定位克隆目的基因片段克隆目的基因片段克隆目的基因片段克隆目的基因片段克隆目的基因片段克隆目的基因片段功能克隆功能克隆 克隆（致病）基因的一种策略。 收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。性状性状性状性状性状性状（疾病）（疾病）（疾病）（疾病）（疾病）（疾病）蛋白质产

4、蛋白质产蛋白质产蛋白质产蛋白质产蛋白质产物（生物物（生物物（生物物（生物物（生物物（生物学功能）学功能）学功能）学功能）学功能）学功能）从氨基酸序列从氨基酸序列从氨基酸序列从氨基酸序列从氨基酸序列从氨基酸序列出发设计出发设计出发设计出发设计出发设计出发设计DNADNADNA引物，从引物，从引物，从引物，从引物，从引物，从文库调取基因文库调取基因文库调取基因文库调取基因文库调取基因文库调取基因得到基得到基得到基得到基得到基得到基因序列因序列因序列因序列因序列因序列染色体定染色体定染色体定染色体定染色体定染色体定位位位位位位 分析异常基因的产物（蛋白质）：分析异常基因的产物（蛋白质）：分析异常基因

5、的产物（蛋白质）：分析异常基因的产物（蛋白质）：分析异常基因的产物（蛋白质）：分析异常基因的产物（蛋白质）： 纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两纯化蛋白质，弄清它是如何引起临床症状的有两条不同的路线：条不同的路线：条不同的路线：条不同的路线：条不同的路线：条不同的路线：1. 1. 1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序进行氨基酸

6、序列测定，据此推测可能的核苷酸序进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNAcDNAcDNA文库文库文库文库文库文库或基因组文库中筛选对应的编码基因；或基因组文库中筛选对应的编码基因；或基因组文库中筛选对应的编码基因；或基因组文库中筛选对应的编码基因；或基因组文库中筛选对应的编码基因；或基因组文库中筛选对应的编码基因；2. 2. 2. 将异常蛋白

7、质制成相应的抗体，从将异常蛋白质制成相应的抗体，从将异常蛋白质制成相应的抗体，从将异常蛋白质制成相应的抗体，从将异常蛋白质制成相应的抗体，从将异常蛋白质制成相应的抗体，从cDNAcDNAcDNA表达文库表达文库表达文库表达文库表达文库表达文库中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过DNADNADNA序列分析确定导致疾病的分子缺陷。序列分析确定导致疾病的分子缺陷。序列分析确定导致疾病的分子缺陷。序列分析确定导致

8、疾病的分子缺陷。序列分析确定导致疾病的分子缺陷。序列分析确定导致疾病的分子缺陷。 绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白化病（如白化病（如白化病（如白化病（如白化病（如白化病（albinismalbinismalbinism）、苯丙酮尿症）、苯丙酮尿症）、苯丙酮尿症）、苯丙酮尿症）、苯丙酮尿症）、苯丙酮尿症（phenylkeonuriaphenylkeonuriaphenylkeonuria， PKUP

9、KUPKU）和镰刀形细胞贫血病）和镰刀形细胞贫血病）和镰刀形细胞贫血病）和镰刀形细胞贫血病）和镰刀形细胞贫血病）和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell diseasesickle-cell diseasesickle-cell disease）等，都是采取的这一策略。）等，都是采取的这一策略。）等，都是采取的这一策略。）等，都是采取的这一策略。）等，都是采取的这一策略。）等，都是采取的这一策略。血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症正常正常正常正常正常正常HbAHbAHbA

10、HbAHbAHbA四条多肽链（四条多肽链（四条多肽链（四条多肽链（四条多肽链（四条多肽链（2 2 2 2 2 2条条条条条条 链，两条链，两条链，两条链，两条链，两条链，两条 链）链）链）链）链）链） 定位克隆定位克隆又称为“逆向遗传学”，始于2020世纪8080年代后期利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。疾病疾病疾病遗传标记，遗传标记，遗传标记，染色体定位染色体定位染色体定位基因基因基因序列序列序列mRNAmRNAmRNAcDNAcD

11、NAcDNA蛋白质产物蛋白质产物蛋白质产物生物学功能生物学功能生物学功能 定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记定位克隆：通过遗传标记 ，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因，先获得某一表型基因在染色体上的定位在染色体上的定位在染色体上的定位在染色体上的定位在染色体上的定位在染色体上的定位 ，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基，再在候选区域内选择已知基因因因因因因 ，进

12、行致病突变的筛选，进行致病突变的筛选，进行致病突变的筛选，进行致病突变的筛选，进行致病突变的筛选，进行致病突变的筛选 ，并获得，并获得，并获得，并获得，并获得，并获得cDNAcDNAcDNA及全基及全基及全基及全基及全基及全基因。因。因。因。因。因。基本思路是通过连锁分析原理进行基本思路是通过连锁分析原理进行基本思路是通过连锁分析原理进行基本思路是通过连锁分析原理进行基本思路是通过连锁分析原理进行基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。基因定位。基因定位。基因定位。基因定位。基因定位。若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较

13、远若多态标记与待定基因距离较远若多态标记与待定基因距离较远 ，则它们在，则它们在，则它们在，则它们在，则它们在，则它们在向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离向子代传递时会发生自由分离 ，呈，呈，呈，呈，呈，呈“连锁平衡连锁平衡连锁平衡连锁平衡连锁平衡连锁平衡”；反之；反之；反之；反之；反之；反之 ，则不发生自由分离，则不发生自由分离，则不发生自由分离，则不发生自由分离，则不发生自由分离，则不发生自由分离 ，而呈现，而呈现，而呈现，而呈现，而呈现，而呈现“共分离共分离共分离共分离共分离共分离”现象现象现

14、象现象现象现象 ，即，即，即，即，即，即“连锁不平衡连锁不平衡连锁不平衡连锁不平衡连锁不平衡连锁不平衡”。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定。据此可在染色体上定位与某一位与某一位与某一位与某一位与某一位与某一DNADNADNA标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。标记相连锁的基因。1. 1. 1. 将基因定位于染色体将基因定位于染色体将基因定位于染色体将基因定位于染色体将基因定位于染色体将基因定位于染色体 特定区段特定区段特定区段特定区段特定区段特定区段2. 2. 2. 候选基因

15、筛选鉴定候选基因筛选鉴定候选基因筛选鉴定候选基因筛选鉴定候选基因筛选鉴定候选基因筛选鉴定 定位克隆的主要目的之一是将目标基因定位于特定染色体上。 主要方法：主要方法： 家系调查法家系调查法 体细胞杂交法体细胞杂交法 核酸杂交技术核酸杂交技术 等等等等A-1A-1A-1型短指（趾）症法拉比（型短指（趾）症法拉比（型短指（趾）症法拉比（型短指（趾）症法拉比（型短指（趾）症法拉比（型短指（趾）症法拉比（FarabeeFarabeeFarabee）190319031903年在他的哈佛大学医学院博士毕业论年在他的哈佛大学医学院博士毕业论年在他的哈佛大学医学院博士毕业论年在他的哈佛大学医学院博士毕业论年在

16、他的哈佛大学医学院博士毕业论年在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的经典例子被全世界的生物学和遗传学教材经典例子被全世界的生物学和遗传学教材经典例子被全世界的生物学和遗传学教材

17、经典例子被全世界的生物学和遗传学教材经典例子被全世界的生物学和遗传学教材经典例子被全世界的生物学和遗传学教材广泛引用。广泛引用。广泛引用。广泛引用。广泛引用。广泛引用。贺林实验室利用布依族、苗族贺林实验室利用布依族、苗族贺林实验室利用布依族、苗族贺林实验室利用布依族、苗族贺林实验室利用布依族、苗族贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三个和汉族的三个和汉族的三个和汉族的三个和汉族的三个和汉族的三个A-1A-1A-1型短指（趾）症大型短指（趾）症大型短指（趾）症大型短指（趾）症大型短指（趾）症大型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精家系，对该病的致病基因进行了精家系，对该病的致病基因进行了精

18、家系，对该病的致病基因进行了精家系，对该病的致病基因进行了精家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在确定位（位点定在确定位（位点定在确定位（位点定在确定位（位点定在确定位（位点定在2 2 2q q q35-3635-3635-36区）、克区）、克区）、克区）、克区）、克区）、克隆，并首次发现了人隆，并首次发现了人隆，并首次发现了人隆，并首次发现了人隆，并首次发现了人隆，并首次发现了人IHHIHHIHH基因和该基因和该基因和该基因和该基因和该基因和该基因上的三个突变位点是导致基因上的三个突变位点是导致基因上的三个突变位点是导致基因上的三个突变位点是导致基因上的三个突变位点是导致基因上的三个

19、突变位点是导致A-1A-1A-1型型型型型型短指（趾）症的直接原因。短指（趾）症的直接原因。短指（趾）症的直接原因。短指（趾）症的直接原因。短指（趾）症的直接原因。短指（趾）症的直接原因。用遗传标记进行基因定位 形态标记形态标记 morphological markers 细胞标记细胞标记 cytological markers 生化标记 biochemical markers 分子标记分子标记 molecular markers分子遗传标记分子遗传标记 在核酸分子水平，对具有相对差异在核酸分子水平，对具有相对差异的等位基因的等位基因DNADNA多态性的标记，广泛存多态性的标记，广泛存在于高等

20、生物编码区和非编码区，又在于高等生物编码区和非编码区，又称为称为DNADNA分子标记，是分子标记，是DNADNA水平上遗传水平上遗传变异的直接反映。变异的直接反映。特点: 1. 直接以DNA形式表现，在生物体各发育阶段,各组织均可检测到。 2.数量多，遍及整个基因组。 3.多态性高，自然界存在许多等位突变，无需专门创造特殊的遗传材料 4. 中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁 5. 许多分子标记表现为共显性（codominance）, 能够鉴别出纯合基因型与杂 合基因型，提供完整的遗传信息 分子遗传标记发展 RFLP restrict fragment length polymor

21、phism 限制性片段长度多态性 SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性简单序列长度多态性 ，又称为VNTR variable number tandem repeat 数目可变的数目可变的串联重复多态性串联重复多态性 指重复单位相对较小, ,由重复单位的序列差异和数目变化, ,可形成丰富的多态性。 包括: : 小卫星序列 minisatellit

22、e 微卫星序列 microsatellite , 小卫星DNA标记 minisatellite，核心序列为1160bp ，主要存在于染色体靠近端粒处，由于其拷贝数变化，在不同个体间中存在串联数目的差异，若在重复序列两侧有限制性内切酶酶切位点，则切下来的片段会呈现出多态性。可用于DNA 指纹，DNA Finger。 微卫星DNA标记 microsatellite，指以27个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列（微卫星DNA microsatellite DNA，又称为STR short tandem repeat 短串联重复序列）,由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性，但在同一家

23、系内具有高度的遗传保守性，以孟德尔方式遗传。散布于整个基因组中。 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性，是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1。 SNP分为两种形式： 基因编码区的SNP，称为cSNP 遍布于基因组内的大量单碱基变异SNPSNP分析的特点：分析的特点： （1 1）SNPSNP数量大，分步密集，平均每1000bp1000bp就有一个SNPSNP （2 2）SNPSNP比STRSTR扩增更有效，不会产生假带 （3 3）由于SNPSNP是二态的，易于自动化批量检测，易于用计算机分析结果 SNP

24、与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于： 不再以“长度”的差异作为检测手段而是直接以序列的差异作为标记。但SNP单个基因座的多态性很差，只有二态，为此采用多个SNP基因座进行“单倍型”分析十分重要。 SNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，该项目研究是阐明基因组功能及特点的重要基础。SNP是人类基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病的重要遗传基础。其他遗传标记举例其他遗传标记举例其他遗传标记举例其他遗传标记举例其他遗传标记举例其他遗传标记举例AFLPAFLPAFLP amplified fragment length polymorphismamplified fra

25、gment length polymorphismamplified fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性RAPD random amplified polymorphism DNA RAPD random amplified polymorphism DNA RAPD random amplified polymorphism DNA 随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性SSCPSSCPSSCP single str

26、and conformation polymorphismsingle strand conformation polymorphismsingle strand conformation polymorphism 单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性AFLP amplified fragment length polymorphism 扩扩增片段长度多态性增片段长度多态性 通过DNA PCR扩增基因组DNA的模板，随后用电泳将扩增片段分离，通过DNA谱带鉴别多态性。RAPD random amplified polymorphism DNA 随

27、机扩增多态性随机扩增多态性 用于扩增多态性DNA的引物是 随机的。在做多态性分析时，用一组引物（20 40个）在基因组全序列上扫描可获得基因组多态 性的丰富信息。 SSCP single strand conformation polymorphism 单单链构象多态性链构象多态性 是基于PCR扩增而新发展起来的DNA多态性分析，利用PCR特异的扩增出基因组的目的DNA片段，变性后形成的单链DNA在自然条件下能形成一定的空间构象，并且这种空间构象由DNA链的碱基序列决定，若碱基发生变化，将在电泳图谱上表现出不同生物个体的特异性，即多态性。 用用用用用用原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交原

28、位杂交 in situ hybridazationin situ hybridazationin situ hybridazation和和和和和和荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交 fluorescence in situ fluorescence in situ fluorescence in situ hybridazationhybridazationhybridazation ,FISH ,FISH ,FISH 进行基因定位：进行基因定位：进行基因定位：进行基因定位：进行基因定位：进行基因定位： 将将将将将将DNADNADNADNADNADNA探针

29、用同位素或荧光染料标记探针用同位素或荧光染料标记探针用同位素或荧光染料标记探针用同位素或荧光染料标记探针用同位素或荧光染料标记探针用同位素或荧光染料标记，按照碱基互补配对原则，与固定在，按照碱基互补配对原则，与固定在，按照碱基互补配对原则，与固定在，按照碱基互补配对原则，与固定在，按照碱基互补配对原则，与固定在，按照碱基互补配对原则，与固定在玻片上的中期染色体杂交后，在荧光玻片上的中期染色体杂交后，在荧光玻片上的中期染色体杂交后，在荧光玻片上的中期染色体杂交后，在荧光玻片上的中期染色体杂交后，在荧光玻片上的中期染色体杂交后，在荧光显微镜下呈现不同颜色的荧光。显微镜下呈现不同颜色的荧光。显微镜下

30、呈现不同颜色的荧光。显微镜下呈现不同颜色的荧光。显微镜下呈现不同颜色的荧光。显微镜下呈现不同颜色的荧光。 FISHFISHFISHFISHFISHFISH是一项十分灵敏的技术，可以是一项十分灵敏的技术，可以是一项十分灵敏的技术，可以是一项十分灵敏的技术，可以是一项十分灵敏的技术，可以是一项十分灵敏的技术，可以检测出非整倍体，基因扩增，微小的检测出非整倍体，基因扩增，微小的检测出非整倍体，基因扩增，微小的检测出非整倍体，基因扩增，微小的检测出非整倍体，基因扩增，微小的检测出非整倍体，基因扩增，微小的染色体重排或易位染色体重排或易位染色体重排或易位染色体重排或易位染色体重排或易位染色体重排或易位等

31、染色体变异等染色体变异等染色体变异等染色体变异等染色体变异等染色体变异原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交基因定位基因定位基因定位基因定位基因定位基因定位多色多色多色多色多色多色FISHFISHFISHM-FISHM-FISHM-FISH技术技术技术技术技术技术荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交FISH在肿瘤发生发展相关染色体变异方面的研究应用：比较基因组杂交技术 comparative genomic hybridization，CGH 利用同一种生物异常细胞的基因组做探针，与正常细胞基因组杂交，通过对杂交信号分析，发现不同，寻找相关基因。利

32、用染色体步移确定基因位置定位候选克隆定位候选克隆该方法是定位克隆的进一步发展将疾病相关基因定位于染色体相关区域该染色体区域得到若干候选基因进一步分析得到目的cDNAcDNA蛋白质功能研究疾疾疾疾疾疾病病病病病病染色体定位染色体定位染色体定位染色体定位染色体定位染色体定位若干候选若干候选若干候选若干候选若干候选若干候选基因基因基因基因基因基因确定目确定目确定目确定目确定目确定目的基因的基因的基因的基因的基因的基因蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白质质质质质质功功功功功功能能能能能能 筛选染色体定位只是定位克隆的第一步。由于筛选、确认的困难 ，使其成为定位克隆策略的“瓶颈”。目前获得基因序列的方法大致有:

33、:(1)(1)对 50 0 50 0的关键部位进行直接测序；(2)(2)比较基因组作图和测序； (3)(3)基因结构特征分析； (4)(4)捕获，主要有岛捕捉层析 法、外显子捕捉法、直接筛选法等方法差异表达差异表达 原理: 比较不同个体或不同细胞来源 ，即通常所指的样本 (tester，) 和参照 (driver，) 的蛋白质或RNA两者之间的差异 ，如缺失或特异表达部分， 从而发现新基因1. 1. 1. 差异性表达差异性表达差异性表达差异性表达差异性表达差异性表达mRNAmRNAmRNA方法方法方法方法方法方法 （1 1 1）mRNAmRNAmRNA差异显示（差异显示（差异显示（差异显示（差

34、异显示（差异显示（mRNA-Differential mRNA-Differential mRNA-Differential Display Display Display，mRNA-DDmRNA-DDmRNA-DD） （2 2 2）抑制性消减杂交（）抑制性消减杂交（）抑制性消减杂交（）抑制性消减杂交（）抑制性消减杂交（）抑制性消减杂交（Suppression Subtractive Suppression Subtractive Suppression Subtractive Hybridization Hybridization Hybridization，SSHSSHSSH） （3 3

35、3）cDNAcDNAcDNA代表性差异分析（代表性差异分析（代表性差异分析（代表性差异分析（代表性差异分析（代表性差异分析（cDNA RepresentationalcDNA RepresentationalcDNA Representational Difference Analysis Difference Analysis Difference Analysis，cDNA-RDAcDNA-RDAcDNA-RDA） （4 4 4）cDNA microarraycDNA microarraycDNA microarray 2. 2. 2. 差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异

36、性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质消减杂交消减杂交（subtractive hybrization） 利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，或者在不同发育阶段、不同状态下表达差异，通过其mRNA或单链cDNA进行杂交，除去两者之间相同的基因成分，使表达有差异的基因得到充分富集。它的实质是对两组基因转录本全面比较，去同存异，分离差异表达基因Subtractive cloningcDNA-RDAcDNA-RDAcDNA-RDA技术技术技术技术技术技术 cDNA-RDAcDNA-RDAcDNA-RDA（cDNA-cDNA-cDNA-Representative Difference A

37、nalysisRepresentative Difference AnalysisRepresentative Difference Analysis）技术是）技术是）技术是）技术是）技术是）技术是199419941994年年年年年年HubandHubandHuband和和和和和和SchatzSchatzSchatz在在在在在在RDARDARDA和和和和和和mRNA-DDmRNA-DDmRNA-DD二者基础上二者基础上二者基础上二者基础上二者基础上二者基础上建立的一种基因克隆新方法建立的一种基因克隆新方法建立的一种基因克隆新方法建立的一种基因克隆新方法建立的一种基因克隆新方法建立的一种基因克隆

38、新方法 在在在在在在代表性差异分析基础上，以代表性差异分析基础上，以代表性差异分析基础上，以代表性差异分析基础上，以代表性差异分析基础上，以代表性差异分析基础上，以mRNAmRNAmRNA表达表达表达表达表达表达水平的差异为差减目标，因而兼有水平的差异为差减目标，因而兼有水平的差异为差减目标，因而兼有水平的差异为差减目标，因而兼有水平的差异为差减目标，因而兼有水平的差异为差减目标，因而兼有RDARDARDA和和和和和和mRNA-DDmRNA-DDmRNA-DD的优点的优点的优点的优点的优点的优点, , ,这一方法克服了这一方法克服了这一方法克服了这一方法克服了这一方法克服了这一方法克服了mRN

39、A-DDmRNA-DDmRNA-DD假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，假阳性率高的缺点，排除与表型无关的基因，通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定通过消减杂交驱逐同源序列，降低了后期鉴定的工作量，但操作烦琐。的工作量，但操作烦琐。的工作量，但操作烦琐。的工作量，但操作烦

40、琐。的工作量，但操作烦琐。的工作量，但操作烦琐。 特点：特点：特点：特点：特点：特点：肿瘤组织肿瘤组织肿瘤组织肿瘤组织肿瘤组织肿瘤组织Driver Driver Driver 正常组织正常组织正常组织正常组织正常组织正常组织TesterTesterTesterAAAAAAAAAAAAAAAAAAmRNAmRNAmRNAds cDNAds cDNAds cDNAMbo I Mbo I Mbo I 酶切酶切酶切酶切酶切酶切连接接头连接接头连接接头连接接头连接接头连接接头PCRPCRPCR扩增扩增扩增扩增扩增扩增无接头无接头无接头无接头无接头无接头换新接头换新接头换新接头换新接头换新接头换新接头杂交

41、杂交杂交杂交杂交杂交无扩增无扩增无扩增无扩增无扩增无扩增线性扩增线性扩增线性扩增线性扩增线性扩增线性扩增指数扩增指数扩增指数扩增指数扩增指数扩增指数扩增cDNA-RDAcDNA-RDAcDNA-RDA方法简要示意图方法简要示意图方法简要示意图方法简要示意图方法简要示意图方法简要示意图因为同一种因为同一种因为同一种因为同一种因为同一种因为同一种mRNAmRNAmRNA经不同的剪接或翻经不同的剪接或翻经不同的剪接或翻经不同的剪接或翻经不同的剪接或翻经不同的剪接或翻译后修饰加工可产生多种蛋白质，因此一译后修饰加工可产生多种蛋白质，因此一译后修饰加工可产生多种蛋白质，因此一译后修饰加工可产生多种蛋白质

42、，因此一译后修饰加工可产生多种蛋白质，因此一译后修饰加工可产生多种蛋白质，因此一个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因个蛋白质组中蛋白质的数量超过相应基因组的基因数目。组的基因数目。组的基因数目。组的基因数目。组的基因数目。组的基因数目。蛋白质组研究常用方法：蛋白质组研究常用方法：蛋白质组研究常用方法：蛋白质组研究常用方法：蛋白质组研究常用方法：蛋白质组研究常用方法： 二维凝胶电泳技术，蛋白质序列分析，二维凝胶电泳技术，蛋白质序列分析，二维凝胶电泳技术，

43、蛋白质序列分析，二维凝胶电泳技术，蛋白质序列分析，二维凝胶电泳技术，蛋白质序列分析，二维凝胶电泳技术，蛋白质序列分析，质谱分析等等。质谱分析等等。质谱分析等等。质谱分析等等。质谱分析等等。质谱分析等等。差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质差异性表达蛋白质生物信息学方法生物信息学方法通过序列的通过序列的ORFORF预测预测 建立建立cDNAcDNA文库文库 差减杂交得到均质化文库差减杂交得到均质化文库 cDNAcDNA序列测定序列测定 生物信息学分析，生物信息学分析，ORFORF预测预测 同源性比较，功能预测同源性比较，功能预测生物信息学（生物信息学（

44、生物信息学（生物信息学（生物信息学（生物信息学（bioinformaticsbioinformaticsbioinformatics）是生物学，计算机科学，以及应用数学等学是生物学，计算机科学，以及应用数学等学是生物学，计算机科学，以及应用数学等学是生物学，计算机科学，以及应用数学等学是生物学，计算机科学，以及应用数学等学是生物学，计算机科学，以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科。科相互交叉而形成的一门新兴学科。科相互交叉而形成的一门新兴学科。科相互交叉而形成的一门新兴学科。科相互交叉而形成的一门新兴学科。科相互交叉而形成的一门新兴学科。 以计算机为主要工具，开发各种软件，对日以计算

45、机为主要工具，开发各种软件，对日以计算机为主要工具，开发各种软件，对日以计算机为主要工具，开发各种软件，对日以计算机为主要工具，开发各种软件，对日以计算机为主要工具，开发各种软件，对日益增长的益增长的益增长的益增长的益增长的益增长的DNADNADNA和蛋白质的序列和结构等相和蛋白质的序列和结构等相和蛋白质的序列和结构等相和蛋白质的序列和结构等相和蛋白质的序列和结构等相和蛋白质的序列和结构等相关信息进行收集、储存、发行、提取、加工关信息进行收集、储存、发行、提取、加工关信息进行收集、储存、发行、提取、加工关信息进行收集、储存、发行、提取、加工关信息进行收集、储存、发行、提取、加工关信息进行收集、储存、发行、提取、加工、分析和研究，同时建立理论模型，