基因克隆的载体

1、基因克隆的载体第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体 载体的概念及特点载体的概念及特点 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors） 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors） 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第1页/共81页引引 言言载体（载体（vector）：能携带目的基因进入宿主细胞进行）：能携带目的基因进入宿主细胞进行 扩增和表达的工具。扩增和表达的工具。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：A. 能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；B. 具有具有1-2个选择标记基

2、因，如对抗生素的抗性基因个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；等；C. 具备多克隆位点（具备多克隆位点（Multiple Clone Sites，MCS），），而且可携带外源而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽片段的长度范围较宽;D. 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和于操作和DNA的制备。的制备。E. 具有较好的安全性，不能任意转移。具有较好的安全性，不能任意转移。第2页/共81页载体的分类载体的分类根据载体工作方式的不同可分为根据载体工作方式的不同可分为质粒载体质粒载体（plasimid vectors）、噬菌体载体（）、噬菌体

3、载体（phage vectors）、）、 噬菌体噬菌体-质粒杂合载体（考斯质粒杂合载体（考斯质粒）质粒） 第3页/共81页质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立于于染色体以外染色体以外的能的能自主的复制自主的复制的裸露的遗传物质。的裸露的遗传物质。大多数质粒是闭大多数质粒是闭合环状双链合环状双链DNA分子，比病毒更分子，比病毒更简单。在霉菌、简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一蓝藻、酵母和一些动植物细胞中些动植物细胞中也发现了质粒。也发现了质粒。一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）第4页/共81页 质粒的特点质粒的特点（1）

4、自主复制性。）自主复制性。质粒含有自己的复制起始位点（质粒含有自己的复制起始位点（Origin,简称简称ori），有些质），有些质粒具有独立的复制子结构（粒具有独立的复制子结构（Replicon），因此，质粒），因此，质粒DNA可以自主复制，形可以自主复制，形成少则几个多则成百上千个拷贝。成少则几个多则成百上千个拷贝。（2）可扩增性。）可扩增性。在格兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种复制形式，即严在格兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型（紧型（Stringent）和松弛型（）和松弛型（Relaxed）。）。第5页/共81页 质粒的复制类型：质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞

5、中存在的数目称为该质粒的一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数。根。根据拷贝数的多少将质粒分为两种复制型：据拷贝数的多少将质粒分为两种复制型：“严紧型严紧型”质粒质粒（stringent plasmid）,拷贝数为拷贝数为1-5；“松弛型松弛型”质粒（质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为拷贝数为6-606-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。变化。第6页/共81页 严紧型质粒（严紧型质粒（Stringent）：这类质粒的复制由细胞内）：这类质粒的复制由细胞内DNA聚

6、合酶聚合酶介导，并被介导，并被质粒上编码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极不稳定使得每个细胞只能复质粒上编码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于制少数几个质粒拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于5个的质粒称为严紧型质粒。个的质粒称为严紧型质粒。 松弛型质粒（松弛型质粒（Relaxed）：这类质粒的复制）：这类质粒的复制需要半衰期较长的需要半衰期较长的DNA聚合酶聚合酶、RNA聚合聚合酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主细胞中一般可达到主细胞中一般可达到3050个拷贝，所以称个拷贝，所以

7、称为松弛型质粒。为松弛型质粒。第7页/共81页 质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生长后期，加入质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生长后期，加入氯霉素可以抑制宿主氯霉素可以抑制宿主细胞蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，细胞蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，松弛型质粒就能松弛型质粒就能利用丰富的原料及能量进行复制，最终每个细胞就能累积上千个利用丰富的原料及能量进行复制，最终每个细胞就能累积上千个DNA分子，分子，把这种操作称为质粒的氯霉素扩增。把这种操作称为质粒的氯霉素扩增。第8页/共81页（3）可转移性。）可转移性。在移动基因在移动基因mob、转移基因转移基因tra、顺式作

8、用元件顺式作用元件bom等因子的作用下，许多等因子的作用下，许多野生型质粒可以通过细胞的接合野生型质粒可以通过细胞的接合（conjugation）作用从一个宿主细胞转）作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞中。移到另一个宿主细胞中。第9页/共81页（4）不相容性。具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳）不相容性。具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定的存在于同一个受体细胞的现象称为质粒的不相容性定的存在于同一个受体细胞的现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。）。细胞分裂细胞分裂第10页/共81页理想质粒的改造与构建理想质粒的改造与构建（1）删除

9、不必要的）删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源区域。尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源DNA的装的装载量；载量； 一般大于一般大于20Kb的质粒转化率很低而且不稳定。的质粒转化率很低而且不稳定。（2）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码质粒转移的）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码质粒转移的mob基因以提高质粒的安基因以提高质粒的安全性，灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提高质粒的拷贝数。全性，灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提高质粒的拷贝数。第11页/共81页（3）加入易于识别的选择标记基因。）加入易于识别的选择标记基因。选择标记基因：选择标记基因：在基因工程中

10、的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的细胞（菌）。通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的细胞（菌）。 常用的抗生素抗性基因有：常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因)、Kanr (卡那霉卡那霉素抗性基因素抗性基因)、Tetr (四环素抗性基因四环素抗性基因)、Cmr 或或cat(氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因)、Neor (新霉素抗性基因新霉素抗性基因)；第12页/共81页LacZM15缺失第缺失第11-41位的氨基酸位的氨基酸LacZ N端端140

11、个氨个氨基酸基酸LacZMCS140个氨基酸个氨基酸+MCSLacZ1024个氨基酸个氨基酸LacZM15F质粒质粒载体载体LacZE.coliLacZ M15+ LacZX-galLacZ M15+ LacZDNAX-gal筛选标记基因：筛选标记基因：-互补互补第13页/共81页 大肠杆菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的 -片段片段和和 -片片段段分开时就失去了这种显色的功能。通常将分开时就失去了这种显色的功能。通常将缺失了第缺失了第11-41位氨基酸的编码位氨基酸的编码 片

12、段的片段的LacZM15构建在构建在F质质粒上先转入大肠杆菌中，而将粒上先转入大肠杆菌中，而将编码该酶编码该酶N端端140个氨基个氨基酸的酸的 -片段片段的的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中。当含有翼序列中。当含有LacZ基因的载体基因的载体导入到这类寄主细导入到这类寄主细胞中时，载体编码的胞中时，载体编码的 -片段片段就能和寄主编码的就能和寄主编码的 片段片段发生互补并具有了对底物发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为是反应），这种现象被称为是 -互补（互补（ alpha-complement

13、ation）.将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）第14页/共81页蓝白斑筛选第15页/共81页（4）在筛选标记基因内引入具有多种限制性）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点，即多克隆位点内切酶识别及切割位点，即多克隆位点（Multiple Clone Site,即即MCS）,便于外便于外源基因的重组；源基因的重组；多克隆位点(MCS)：克隆载体中的一段用于插克隆载体中的一段用于插入外源入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整

14、个载体中是唯一限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。的。（5）根据外源基因克隆和表达的不同）根据外源基因克隆和表达的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件。要求，加装特殊的基因表达调控元件。第16页/共81页质粒的分类：质粒的分类：根据其功能和用途将根据其功能和用途将人工构建的质粒分为以下几类：人工构建的质粒分为以下几类：克隆质粒、测序质粒、整合质粒、克隆质粒、测序质粒、整合质粒、穿梭质粒、探针质粒、表达质粒穿梭质粒、探针质粒、表达质粒等。等。第17页/共81页质粒的种类及用途质粒的种类及用途（1 1）克隆质粒。）克隆质粒。用于用于克隆和扩增外源基因克隆和扩增外源基因。第18页/共81页（2

15、）测序质粒。有MCS，并在MCS两端设有两个不同的引物，便于DNA测序。如pUC18/19。第19页/共81页（3）整合质粒。）整合质粒。含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这类质粒上的含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞染色体基因组的特定位点上。基因在进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞染色体基因组的特定位点上。（4）穿梭质粒。）穿梭质粒。这类质粒含有两种不同的复制子结构及相应的选择标记性基因，因此这类质粒含有两种不同的复制子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两种不同的种属细胞中复制并检测。如大肠杆菌能在

16、两种不同的种属细胞中复制并检测。如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌-酵酵母菌穿梭质粒。母菌穿梭质粒。（5）探针质粒。）探针质粒。这类载体用来构建或筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止这类载体用来构建或筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子。子。第20页/共81页（6）表达质粒。）表达质粒。这类质粒在这类质粒在MCS的上游和下游分别装有两套转录效率较高的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子结构使序列）以及强有力的终止子结构使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细

17、胞中高效表达，如得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pET系列质粒。系列质粒。第21页/共81页第22页/共81页质粒DNA的提取与纯化第23页/共81页大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组DNA 第24页/共81页一、质粒DNA的提取第25页/共81页plasmid DNAThe genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.Genomic DNA 第26页/共81页闭合环状的

18、质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；（1）原理1. 碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱中性中性第27页/共81页染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结复合物结合在一起，在离心的时候合在一起，在离心的时候沉淀沉淀下去。下去。变性变性第28页/共81页 碱变性法 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。通过加热，

19、尤其是在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。第29页/共81页（2） 所用的试剂作用 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡

20、萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。第30页/共81页EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的的活性，防止活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供：强碱，提供pH12的碱性条件，的碱性条件，使使DNA双链双链变性变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成结合成“蛋白蛋白SDS”复合物复合物，使蛋白质，使蛋白质（包括（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。 第31页/共81页用冰醋酸将醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓

21、度的高浓度的NaAc有利于变性的大分子有利于变性的大分子（蛋白质、（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。用于沉淀DNA。 乙醇DNA分子以分子以水合状态水合状态“溶于溶于”水里，水里，乙醇能夺去乙醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。 NaAc-HAc缓冲液第32页/共81页 RNase A降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；液或硼酸缓冲液），有利于以后操作； EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，

22、防止DNA被酶降解。被酶降解。第33页/共81页蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。也可以自己配制。第34页/共81页（3）碱裂解法提取质粒DNA的步骤 Solution I 的配制：的配制：使用“溶液”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶， RNase A（5-10mg/L）第35页/共81页溶液II 破坏细胞膜，蛋

23、白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性Solution II 的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。Solution III的配制：0.4N NaOH，2.0%SDS3M 醋酸钠（用冰醋酸调醋酸钠（用冰醋酸调pH至至4.8）第36页/共81页最重要的是：2. 影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。一般要使用一般要使用endA基因基因发生突变的大肠杆菌发生突变的大肠杆菌菌株。如菌株。如DH5 、JM109、XL1-Blue等。等。（1）受体菌株endA基因编码基因编码核酸内切酶核酸内切酶，在在Mg2+的

24、存在的存在下可将双链下可将双链DNA消化成消化成7bp的寡核苷酸片断。的寡核苷酸片断。第37页/共81页这是直接决定这是直接决定DNA产量的重要因素之一。产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定质粒本身的性质所决定。第38页/共81页pBR3224363连接加反应液Tet or AmpTet + AmpCK+2. 质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍第39页/共81页质粒的存在形式：质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（超螺旋）环（超螺旋）coval

25、ently closed circular DNA, 简称简称cccDNA开环双螺旋（一开环双螺旋（一个裂口）个裂口）open circular DNA, 简称简称ocDNA线状双螺旋（两线状双螺旋（两个裂口）个裂口）linear DNA,简称简称L-DNA第40页/共81页三种形式的质粒在琼脂糖凝胶电三种形式的质粒在琼脂糖凝胶电泳中的分离情况泳中的分离情况第41页/共81页第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）二二 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）三三 柯斯质粒载体（柯

26、斯质粒载体（cosmid vectors） 第42页/共81页二二 噬菌体载体噬菌体载体（phage vectors）1、 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体噬菌体载体第43页/共81页1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性The Phage consist of a linear c h r o m o s o m e enclosed in a p r o t e i n c o a t (capsid,衣壳衣壳 ). When the phage infecting the host cel

27、ls, it injects its DNA into the host bacterium. 第44页/共81页1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 噬菌体的生长周期可分为噬菌体的生长周期可分为溶菌周期（溶菌周期（Lytic cycle）和和溶原周期（溶原周期（Lysogenic cycle）两种类型。两种类型。前者指前者指噬菌噬菌体将体将DNADNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌

28、体。在溶原周期溶原周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细胞染是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。 只有溶菌生长周期的噬菌体被称为只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体烈性噬菌体。只有溶原周期的噬菌体被称为只有溶原周期的噬菌体被称为温和噬菌体温和噬菌体。整合了一。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶原性细菌溶原性细菌。在。在溶原性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体溶原性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被称被称为为原噬菌体原噬菌体。第45页/共

29、81页溶原周期（Lysogenic cycle）溶菌周期（Lytic cycle）第46页/共81页1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 DNA为线状双链为线状双链DNA分子分子，长度为，长度为48502bp，在，在分子两端各有分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端个碱基的单链互补粘性末端。当其注入。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为补形成的双链区被称为cos位点位点（cohesive end site）.

30、DNA至少包括至少包括61个基因，个基因，其中一部分为噬菌体生其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不命活动的必须基因，另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能。会影响到噬菌体的正常功能。第47页/共81页 噬菌体的头部外壳蛋白对噬菌体的头部外壳蛋白对DNA分子的包装与分子的包装与DNA内部的序列无内部的序列无关，只识别两个关，只识别两个cos位点，同时对位点，同时对包装的包装的DNA分子的大小有严格的分子的大小有严格的要求：其包装范围为要求：其包装范围为 DNA 总长总长的的75% 105%，即，即36.4kb 50.9kb.第48页/共81页2.

31、DNA载体的构建载体的构建（1）缩短野生型）缩短野生型 DNA的长度，提高外源的长度，提高外源DNA的装的装载量。即在不影响其体内复制、裂解及包装功能的载量。即在不影响其体内复制、裂解及包装功能的前提下尽量缩小其分子长度；前提下尽量缩小其分子长度；（2）删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点；）删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点；（3）灭活一些与裂解周期有关的基因，使）灭活一些与裂解周期有关的基因，使 DNA载载体只能在特殊的条件下感染裂解宿主菌，以避免可体只能在特殊的条件下感染裂解宿主菌，以避免可能出现的生物污染；能出现的生物污染；（4）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的）引入合适

32、的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测。检测。第49页/共81页（1） 插入型载体（插入型载体（Insertion vectors ） selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI genecI+cI-Lysogenic cycleLytic cycleclear plaquescloudy plaques 噬菌体载体的分类及用途噬菌体载体的分类及用途第50页/共81页（1） Insertion vectorsLambda gt10 Lambda gt10 was designed for the cloni

33、ng of relatively short DNA fragments, especially cDNA. The vector accepts EcoRI ended fragments up to 7.6 kb. Insertion of the DNA inactivates the lambda repressor (gene i434) resulting in clear plaques. b527 is a deletion of part of the Lambda genome. A . J are structural genes. 第51页/共81页（1） Insert

34、ion vectorsLambda gt11 Lambda gt11 can accept fragments up to 7.2 kb in length in a unique EcoRI site near the end of the E. coli LacZ gene. This allows production of fusion proteins from the Lac promoter. Recombinant phage can then be distinguished by detection of the product of the cloned DNA usin

35、g antibodies and also by detecting the inactivation of the LacZ gene on plates containing X-Gal/IPTG. nin5 is a deletion of the Lambda genome.第52页/共81页（1） Insertion vectorsLambda ZAP This vector was designed to construct cDNA libraries. It can accept up to 10 kb of foreign DNA in one of six unique c

36、loning sites. Cloning in these sites results in insertional inactivation of LacZ allowing detection on X-Gal/IPTG plates. It also allows expression of the protein product under control of the Lac promoter and detection by specific antibodies. 第53页/共81页(续上一页续上一页) The vector contains the pBluescript p

37、lasmid, allowing strand-specific transcription of insert DNA. A more important feature, however, is that the pBluescript plasmid insert is flanked on one side by the initiator region of phage f1 promoter, and on the other side by the terminator region of the f1 promoter. This means that the pBluescr

38、ipt plasmid, complete with insert, can be excised and packaged by superinfection(双重感染双重感染) with phage f1. This can then be transferred to a suitable host E. coli strain where the plasmid is maintained and can be used for sequencing. This automatic subcloning greatly speeds up the acquisition of a se

39、quence from a clone in a gene library.第54页/共81页（2）取代型载体（取代型载体（Replacement vectors）第55页/共81页2. 噬菌体载体噬菌体载体（2）取代型载体（取代型载体（Replacement vectors） Another approach to the construction of vectors from phage Lambda is to cut out a portion of the DNA by virtue of （依靠）（依靠）a pair of restriction sites. The 49 kb

40、 Lambda genome can lose 40 % of its content which can be replaced by foreign DNA. This means that inserts of up to 20-25 kb can be cloned. These vectors are particularly useful for making gene libraries from mammalian sources. 第56页/共81页 When such a vector is cut by a restriction endonuclease, a stuf

41、fer fragment is removed, leaving right and left arms. The stuffer is usually removed by alcohol precipitation and the arms attached to a foreign DNA insert prepared using the same restriction endonuclease. Lambda DNA has cohesive ends. These can attach to each other to form the cos site of a concato

42、mer. This polymeric molecule can then be packaged into phage using an in vitro packaging system. In order to be packaged, the distance between the cos sites must be greater than 40 kb and less than 52 kb.续前一页续前一页第57页/共81页（2） （Replacement vectors）EMBL 3 and 4 Lambda EMBL vectors are useful for clonin

43、g inserts from 9 to 23 kb in length. Polylinkers are present either side of the stuffer fragment. The order of the cloning sites in the polylinker in EMBL 3 is reversed in EMBL 4. Double digestion of the vector with, in the case of EMBL 3, EcoRI and BamHI prevents the re-association of the stufferf

44、r a g m e n t (carrying EcoRI ends) with the arms (carrying BamHI ends).第58页/共81页二二 噬菌体载体噬菌体载体（phage vectors）1、 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体噬菌体载体第59页/共81页3. M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 M13是线状的大肠杆菌噬菌体是线状的大肠杆菌噬菌体，颗粒内含有，颗粒内含有6047个个核苷酸的闭合环状单链核苷酸的闭合环状单链DNA基因组，其基因组，其单链的基因组单链的

45、基因组DNA经改造后可作为单链的经改造后可作为单链的DNA载体。载体。 因为因为M13单链单链DNA的的复制型复制型（RF，replicative form）是是呈双链环形呈双链环形，此时的，此时的DNA可以象质粒可以象质粒DNA一样进行一样进行提取和体外操作。不论是双链还是单链的提取和体外操作。不论是双链还是单链的M13 DNA均均能感染寄主细胞。而且能感染寄主细胞。而且M13的颗粒不受包装的限制的颗粒不受包装的限制，根，根据据DNA的多寡其噬菌体的颗粒可大可小。的多寡其噬菌体的颗粒可大可小。 M13噬菌体将噬菌体将DNA正链注入寄主细胞后与单链正链注入寄主细胞后与单链DNA 结合蛋白结合，

46、随后以小结合蛋白结合，随后以小RNA链为引物合成负链而转变链为引物合成负链而转变成成RF。第60页/共81页 正链和负链出现不对称性积累：正链和负链出现不对称性积累：当当RF积累到积累到100-200个拷贝后，噬菌体个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到很快参入到外壳蛋白中形成大量新的噬菌体颗粒。外壳蛋白中形成大量新的噬菌体颗粒。 新组装的噬菌体颗粒新组装的噬菌体颗粒并不会发生溶菌现象并不

47、会发生溶菌现象，只是从，只是从寄主细胞中挤压出去。但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄寄主细胞中挤压出去。但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长，所以仍可产生主细菌的正常生长，所以仍可产生模糊的噬菌斑模糊的噬菌斑。 在在M13基因组中有一段基因组中有一段507bp的基因间隔区的基因间隔区，该区，该区可以接受外源可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。载体的重要前提。3. M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性第61页/共81页3. M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 SS RF

48、 1-1RF RF 1-20RF SS 20以上以上The typical life cycle of M13The typical life cycle of M13第62页/共81页二二 噬菌体载体噬菌体载体（phage vectors）1、 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性2、 噬菌体载体噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体噬菌体载体第63页/共81页4. M13噬菌体载体噬菌体载体 后表现不稳定，在噬菌体后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。增殖过程中容易发生缺失。所以所以一般克隆的片段在一般克隆的片段在1kb之内之内，克隆，克隆30

49、0-400bp的片的片段十分稳定。段十分稳定。 载体中含有载体中含有LacZ基因及基因及位于其中的多克隆位点，所位于其中的多克隆位点，所以以能通过能通过 互补在互补在X-Gal/ IPTG平板上平板上识别重组体识别重组体。这类载体包括了这类载体包括了 M13mp8、9 和和 M13mp18 、 19等。等。 这类载体的这类载体的突出优点突出优点在于其既可以提供单链在于其既可以提供单链DNA，也可，也可以提供双链的以提供双链的DNA。其。其最大的不足在于最大的不足在于插入大的插入大的DNA片段片段第64页/共81页第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）

50、一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）二二 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）三三 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第65页/共81页三三 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点 柯斯质粒是一类人工构建的含有柯斯质粒是一类人工构建的含有 DNA的的cos序序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是是cos site carrying plasmid的缩写。的缩写。柯斯质粒的大小为柯斯质粒的大小为4-6kb，由由3部分组成：部分

51、组成： A.多克隆位点区多克隆位点区 B. 含有含有cos位点的位点的 DNA区区 C. 复制起始位点和抗性标记区复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScos DNA第66页/共81页三三 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点1 1、具有、具有 噬菌体的特性噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外柯斯质粒连接上适宜长度的外源源DNADNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的细胞。进入寄主细胞的DNADNA也能环化和复制，但是不会形成也能环化和

52、复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2 2、具有质粒载体的特性、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3 3、高容量的克隆能力、高容量的克隆能力 coscos质粒本身很小，只有复制起质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和点、选择标记和coscos位点等构成，所以其克隆上限可达位点等构成，所以其克隆上限可达45kb45kb左右。不过由于

53、包装的限制，其克隆片段至少要达到左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb30kb。第67页/共81页三三 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的应用柯斯质粒载体的应用 噬菌体的位点特异切割体系噬菌体的位点特异切割体系末端酶（末端酶（terminase）体系要求两个）体系要求两个cos位点间要保持位点间要保持38-54kb的距离。的距离。 下面的操作中缺点是：下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源自我重组、外源DNA片段串联片段串联 后重组。后重组。OriMarkerMCScos DNA第68页/共81页三三 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（c

54、osmid vectors）柯斯质粒载体的应用柯斯质粒载体的应用19811981年，年，Ish-HorowicsIsh-Horowics和和BurkeBurke设计了一种特设计了一种特殊的克隆方案，在所用殊的克隆方案，在所用的质粒上的的质粒上的BamBamHIHI位点位点的两侧各有一个的两侧各有一个EcoEcoRIRI位点包围着。这样在位点包围着。这样在BamBamHIHI位点克隆的位点克隆的DNADNA片片段可以用段可以用EcoEcoRIRI重新切重新切割下来。割下来。cosHindIIIBamHISal ISal IHindIII磷酸化酶磷酸化酶Sal IBamHIBamHIHindIIIBamHIBamHISal IHindIIISau 3A磷酸磷酸 化酶化酶32-47 kb第69页/共81页小