分子生物学DNA复制汇总

1、第二章第二章 基因的分子特性基因的分子特性u 核酸的化学组成核酸的化学组成u 核酸的二级结构核酸的二级结构u DNA的理化性质的理化性质u 超螺旋和真核染色超螺旋和真核染色 体的组装体的组装第一节第一节 遗传物质特性遗传物质特性嘧啶嘧啶Pyrimidines嘌呤嘌呤Purines 多聚核苷酸的化学本质多聚核苷酸的化学本质 碱基碱基Nitrogenous basesUracil (U) 核糖核糖The sugars of nucleic acids 核苷（核苷（nucleotide）嘧啶的嘧啶的1 1位位NN原子、嘌呤的原子、嘌呤的9 9位位NN原子原子核糖是戊糖核糖是戊糖 RNA核糖核苷核糖核

2、苷(R=OH) DNA脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷(R=H)19糖苷键糖苷键Glycosidic bond 核苷酸（核苷酸（nucleotide acid）核苷的磷酸酯核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸核糖核苷酸其中其中和和、和和之间是之间是高能磷酸键高能磷酸键dATPdNTPCMPNMP第二节第二节 DNA结构结构一一、DNA分子的一级结构分子的一级结构(DNA sequence)l 多聚核苷酸链多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸主链是核糖和磷酸 侧链为碱基侧链为碱基由由3,53,5磷酸二酯键磷酸二酯键连连接接l 链的方向链的方向：同一个磷酸基：同一个磷酸基 的的33酯键到酯键到

3、55酯键的方向酯键的方向 (5(53) ) 5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默认书写顺序默认书写顺序5335l DNA DNA一级结构的特点一级结构的特点 a a、脱氧核糖是其显著特点、脱氧核糖是其显著特点 DNADNA极其稳定的根本原因极其稳定的根本原因酮式酮式烯醇式烯醇式酮式酮式烯醇式烯醇式 DNADNA在酸性条件在酸性条件 下的稳定性？！下的稳定性？！RNA RNA 在高在高pHpH时则稳定性很差时则稳定性很差 由于由于22OHOH导致的水解导致的水解OH自由的自由的 5-OH 2, 3-环式单核苷酸环式单核苷酸碱如：如：37, 0.3MKOH,1h12-18h b b、

4、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平 面的面的C C、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的 主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在 生理条件下离解为负离子生理条件下离解为负离子 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象l 一级结构的概念一级结构的概念 指指DNADNA分子中的核苷酸排列顺序，通过分子中的核苷酸排列顺序，通过3,5-3,5-磷酸二酯磷酸二酯键相连形成的线形结构键相连形成的线形结构 不同

5、生物借此贮存遗传信息不同生物借此贮存遗传信息 决定决定DNADNA的二级结构和高级结构的二级结构和高级结构二二、 DNA双螺旋模型结构双螺旋模型结构（double helix model）1.1.双螺旋结构提出背景依据双螺旋结构提出背景依据 a a、 1938. W. T. Astbury 1938. W. T. Astbury 首次用首次用X X射线分析射线分析DNADNA b b、 1950 Chargaff 1950 Chargaff A + G / T + C = 1 A + G / T + C = 1 A+T G + C A+T G + C c c、 1952 Alexander T

6、odd1952 Alexander Todd 发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接 d d、 1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin 得到了高度定向的得到了高度定向的DNADNA纤维的纤维的X-X-射线照片射线照片 发现原子长轴存在发现原子长轴存在0.340.34和和3.4nm3.4nm两种周期性两种周期性 此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（成，且直

7、径恒定（2nm)2nm)。DNA结构的3种模型1953. Watsosn & Crick1953. Watsosn & Crick 2. 双螺旋的主链双螺旋的主链每一单链具有每一单链具有5 35 3极极性性 两条单链极性两条单链极性相反相反 反向平行反向平行两条单链间以两条单链间以氢键连接氢键连接C-GT-A 碱基互补碱基互补以中心为轴，以中心为轴，向右盘向右盘 旋（旋（直直径径2nm2nm）碱基是碱基是扁平扁平结结构，位于内部，构，位于内部，成对且垂直于成对且垂直于螺旋轴螺旋轴双双 螺螺 旋旋 中中 存存 在在大，小大，小 沟沟 直径直径203. 双螺旋模型参数双螺旋模型参数

8、 螺距为螺距为34（任一条链（任一条链 绕轴一周所升降的距离）绕轴一周所升降的距离） 每圈有每圈有1010个核苷酸个核苷酸 （碱基）（碱基） 有大沟和小沟有大沟和小沟 配对碱基并不充满双配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称占据的空间不对称 两个碱基之间的垂直两个碱基之间的垂直 距离是距离是3.43.4。螺旋转。螺旋转 角是角是36度度Pitch 34 Rise3.4 Width 20 Major GrooveMinor Groove10.4 bp/turn 大、小沟的差异大、小沟的差异 大沟中碱基差异容易识别大沟中碱基差异容易识别, ,往往是往往是 蛋白质

9、因子结合特异蛋白质因子结合特异DNADNA序列的位点序列的位点 小沟相对体现的信息较少小沟相对体现的信息较少 O,N:O,N:氢键受体氢键受体a aNH2NH2：氢键供体：氢键供体d d大沟大沟(a-d-a)(a-d-a)小沟（小沟（a-aa-a）大沟大沟(a-a-d, d-a-a)(a-a-d, d-a-a)小沟（小沟（a-d-aa-d-a）4.4.双螺旋结构的基本形式双螺旋结构的基本形式ABZHandednessBase InclinationABZ大沟宽大沟宽小沟窄小沟窄小沟窄小沟窄大沟窄深大沟窄深小沟宽浅小沟宽浅大沟不存在大沟不存在小沟窄而深小沟窄而深 表表 2.1 A、B 及及 Z

10、型螺旋的主要特征概括型螺旋的主要特征概括 A 型型 B 型型 Z 型型 螺旋方向螺旋方向 右手右手 右手右手 左手左手 直径直径 约约 2.6nm 约约 2.0nm 约约 1.8nm 每匝螺旋碱基数每匝螺旋碱基数（n） 11 10 12（6 个二聚体个二聚体） 每对碱基旋转角度每对碱基旋转角度（360/n） 33? ? 36? ? 60? ? 每对碱基螺旋上升每对碱基螺旋上升（h） 0.26nm 0.34nm 0.37nm 螺距螺距 2.8nm 3.4nm 4.5nm 碱基对与中心轴倾角碱基对与中心轴倾角 20? ? 6? ? 7? ? 大沟大沟 乍，乍，深深 宽，宽，深深 平坦平坦 小沟小沟

11、 宽宽，浅浅 乍乍，深深 乍，乍，深深 糖苷键糖苷键 anti anti anti（嘧啶嘧啶） syn（嘌呤嘌呤） 序列序列 Any Any 嘌呤、嘧啶交替嘌呤、嘧啶交替排列排列 存在的条件存在的条件 DNA-Na crytic D.S RNA DNA/RNA Normal 4M Na+ 三、超螺旋（三、超螺旋（superhelix OR supercoil） 最早在最早在SV40SV40和多瘤病毒和多瘤病毒 中发现中发现 超螺旋是所有线性或环超螺旋是所有线性或环 形形DNADNA的共有的重要特征的共有的重要特征The supercoils of the SV40 minichromosome

12、 can be relaxed to generate a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.l 超螺旋结构的方向性超螺旋结构的方向性B-DNA紧缠紧缠overwinding overwinding (右旋右旋) 正超螺旋正超螺旋（positive supercoiled ）导致左手超螺旋导致左手超螺旋B-DNA松缠松缠unwindingunwinding (左旋左旋) 负超螺旋负超螺旋（Negative Supercoiled ）导致右手超螺旋导致右手超螺旋

13、 所有生物的所有生物的DNA几乎几乎 有有5%为为 Negative Superhelix ?!l 超螺旋状态的描述超螺旋状态的描述数学公式描述数学公式描述Vinograd 方程式方程式L = T + W ( = + )L 连接数（连接数（Linking number ） cccDNA分子两链的交叉数分子两链的交叉数T 盘绕数（盘绕数（Twisting number ） 双链双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数的缠绕数，初级螺旋圈数W 超螺旋数超螺旋数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数直观上为双螺旋在空间的转动数W= 负值（负值（negative superhelix

14、）W = 正值正值 ( positive superhelix） In vitroEB insertedNeg. Pos.Superhelix change base base3.4埃埃EB 7.0埃埃 base basebasebase体外可产生正超螺旋体外可产生正超螺旋360o-26o/helix / One of EB insertedcccDNA不同构型的不同构型的DNA沉降系数和迁移率不同沉降系数和迁移率不同Linear DNA. LOpen Circle DNA OC relexed formSupercoiled circle(高级结构高级结构)Covalent Closed C

15、ircle CCC负负 Superhelix OC, L, DNA 正正 Superhelix EB对超螺旋结构的影响对超螺旋结构的影响L (linking Num.)不变不变T (Twisting Num.)减少减少(-26o/helix / 0ne of EB inserted) L= T+WW = L - T = 正值正值 DNA向紧缩方向发展向紧缩方向发展0 0.05 0.1 第三节第三节 DNA的物理、化学性质的物理、化学性质一、一、DNADNA分子变性分子变性 (DNA denaturation)D.S. DNAS.S. DNA 加热加热, , 极端极端pH,pH,有机溶剂（有机溶

16、剂（ 尿尿素、素、 酰胺酰胺 ) )，低盐浓度等，低盐浓度等1 1、条件：、条件：2 2、变性过程的表现、变性过程的表现 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很 窄的温度范围窄的温度范围 导致一些理化性质发生剧烈变化导致一些理化性质发生剧烈变化 熔液黏度降低熔液黏度降低 沉降速度加大沉降速度加大 浮力密度上升浮力密度上升 此外吸收值升高（此外吸收值升高（A260nmA260nm），即），即增色效应增色效应 指在指在DNADNA变性的过程中，在变性的过程中，在260nm260nm的吸收值先是的吸收值先是 缓慢上升，达到某一温度时及骤然上升缓慢上升

17、，达到某一温度时及骤然上升1.1851.01.37ODConcentration 50g/ml Opetical Density D.S DNA A260 = 1S.S DNA A260 = 1.37dNTPs A260 = 1.60 = OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95) Tm (melting temperature) = midpoint of the temperature range over which DNA is denatured Marmur-Doty formula Evaluation GC% of DNA Tm = 69.3 + 0.41

18、GC% 1x SSCGC% = 30-70% ( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate )Tm1 Tm21.01.1851.37ODwhat is meaning ?注意事项: DNA的的GC含量同样含量同样影响其密度影响其密度 OD260的应用：DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40 g/ml单链DNA 33 g/ml寡核苷酸判断核苷酸样品的纯度 DNA纯品：OD260/OD280=1.8 RNA纯品：OD260/OD280=2.03 3、影响、影响 TmTm值的因素值的因素 （1） 在在 A, T, C, G 随机

19、分布的情况下随机分布的情况下 ，决定于，决定于GC含量含量 （2）GC%含量相同的情况下含量相同的情况下GC%愈高愈高 Tm值愈大；值愈大；GC%愈低愈低Tm 值愈小值愈小 AT形成变性核心，变性加快，形成变性核心，变性加快，Tm 值小值小 碱基排列对碱基排列对Tm值具有明显影响值具有明显影响 5 GC 3 CG n 5 CG 3 GC n5 TA 3 AT n5 AT 3 TA n36.7 57.02 Tm136.12 72.55 嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响Pyrimidine-Purine Steps Have Little

20、 Base Stacking5335CGAT 5 CA 3 3 GT 5 Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking533CATG5 5 AC 3 3 TG 5 生物体内仅生物体内仅UAA为最有效的终止密码子为最有效的终止密码子 因为：因为： UAA UAA AUU AUU 的的TmTm值是最低的一个，即使生值是最低的一个，即使生 理温度下也不稳定理温度下也不稳定（3） 大片段大片段D.S DNA分子之间比较分子之间比较片段长短对片段长短对Tm值的影响较小值的影响较小, 与组成和排列相关与组成和排列相关（4） 小于小于100bp 的

21、的 D.S DNA分子比较分子比较片段愈短，片段愈短， 变性愈快，变性愈快，Tm值愈小值愈小（5） 变性液中含有尿素，甲酰胺等变性液中含有尿素，甲酰胺等尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键 改变碱基对间的氢键改变碱基对间的氢键 Tm 值可降至值可降至40左右左右 （6）盐浓度的影响）盐浓度的影响 单链单链DNA主链的磷酸基团主链的磷酸基团负电荷的静电斥力负电荷的静电斥力两条单链两条单链DNA的分离的分离 Na+在磷酸基团周围形成的电子云在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用对静电斥力产生屏蔽作用减弱静电斥力减弱静电斥力Tm 当当Na+浓度低浓度低屏蔽作用小屏蔽作用

22、小斥力加强斥力加强Tm 静电斥力静电斥力 熵值（熵值（S）TmOD A260 0.01M0.1M1.0MNa+当当Na+浓度高浓度高 屏蔽作用大屏蔽作用大斥力减弱斥力减弱熵值熵值(S)上升上升碱基溶解性降低碱基溶解性降低疏水作用力增加疏水作用力增加 pH 12 酮基酮基 烯醇基烯醇基pH 2-3NH2 NH2+ (质子化质子化) 改变氢键的形成与结合力改变氢键的形成与结合力（7） 极端极端pH条件的影响条件的影响一切减弱氢键，一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素碱基堆积力的因素 均将使均将使Tm 值降低值降低4 4、 常用的变性方法常用的变性方法 热变性热变性 碱变性碱变性应用广泛，特别是用于变性

23、动力学研究应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链pH11.3时，全部氢键被淘汰时，全部氢键被淘汰无热变性的缺点，为制备单链无热变性的缺点，为制备单链DNADNA的首选方法的首选方法 保存单链保存单链DNADNA的条件的条件 保持保持pHpH大于大于11.311.3 盐浓度低于盐浓度低于0.01mol/L0.01mol/LD.S DNAS.S DNADenaturation Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on th

24、e collision of complementary S.S. DNA ) 二、二、 DNA分子的复性分子的复性 （anneal or renaturation）影响影响DNA复性过程的因素复性过程的因素 ： 阳离子浓度阳离子浓度 0.18 0.2M Na+ 可消除可消除polydNt 间的静电斥力间的静电斥力 复性反应的温度复性反应的温度 低于低于Tm值值 25左右左右 (60-65) S.S, DNA 的初始浓度的初始浓度 C0 DNA 分子中分子中, dNt 的排列状况的排列状况 (随机排列随机排列, 重复排列重复排列) S.S. DNA分子的长度（片段的大小）分子的长度（片段的大小

25、）S.S. DNA愈长愈长S.S. DNA愈短愈短 分子扩散愈慢分子扩散愈慢 复性愈慢复性愈慢 分子扩散愈快分子扩散愈快 复性愈快复性愈快3-ATCTATGCTGTCAT-55-TAGATACGACAGTA-35-TAGATACGACAGTA-33-ATCTATGCTGTCAT-53-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-33-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-35-TATATATATATA-33-ATATATATATAT-53-ATATATATATAT-55-TATATATATATA-3三、三、Molecular Hybridization (核酸

26、, 蛋白质分子杂交)1 1、定义、定义 ( (核酸分子核酸分子杂交，杂交， “DNADNA印迹杂交印迹杂交”) ) 不同来源的单链不同来源的单链DNADNA与单链与单链DNADNA、RNARNA与与 单链单链DNADNA分子分子间间 在长于在长于20 bp20 bp的同源区域内的同源区域内 以氢键连接方式互补配对以氢键连接方式互补配对 形成稳定的双链结构的过程形成稳定的双链结构的过程用途用途 检测检测DNADNA的缺失、插入，的缺失、插入，考察不同生物种类在进化中的考察不同生物种类在进化中的关系关系2 2、分子杂交的检测、分子杂交的检测D.S. DNAX-filmColumn absorb D

27、.S DNAp32 or biotinlabeledS.S. DNA ( as probe) S.S. DNAS.S. RNA显微镜观察或放射自显影显微镜观察或放射自显影3 3、杂交形式、杂交形式 固相杂交（滤膜）固相杂交（滤膜） 液相杂交液相杂交固相分子杂交固相分子杂交 类型类型 （1975 E. M. Southern1975 E. M. Southern） 放射自显影DNA印迹转移探针杂交Southern BlottingSouthern Blotting的过程的过程1.1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNADNA2.2.通过电泳液的移动转移胶中的通过电泳液的

28、移动转移胶中的DNADNA3.3.固定胶中的固定胶中的DNADNA4.4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5.5.结果检测结果检测传统和现代杂交实验示意图传统和现代杂交实验示意图原位杂交原位杂交/平板杂交平板杂交Southern/Northern 点杂交点杂交Southern/Northern 杂交杂交Western 杂交杂交微孔板杂交微孔板杂交DIGDIG分子示意图分子示意图学生杂交实验结果学生杂交实验结果JM83 DNA (EcoRV)JM83 DNA (BglI)JM83 DNA (NcoI) pMD-phoA lasmid DNA (BamHI/PstI

29、)M. MarkerDIG分子杂交转膜分子杂交转膜 1975 E. M. Southern1975 E. M. Southern 1977.1977. J.C. AlwineJ.C. Alwine 1978.1978. Hany TowbinHany TowbinNorthern blotWestern blotS.S. RNA S.S. DNAProtein (antigen ) antibodySouthern blotS.S. DNA S.S. DNA 原位分子杂交原位分子杂交 (In situ hybridization ) Western印迹（免疫印迹）印迹（免疫印迹）检测重组体克隆

30、的检测重组体克隆的菌落杂交菌落杂交技术技术原位杂交原位杂交In situ hybridizationLocalization of DNALocalization of RNASouthern blotNorthern blotWestern blotFISH四、基因组的大小和四、基因组的大小和C值悖理值悖理 基因组（基因组（genome）：是指细胞或生物体的全套遗传物：是指细胞或生物体的全套遗传物 质，即质，即。 比如比如人人基因组的全长为大约基因组的全长为大约3 310109 9对对碱基，编码碱基，编码 3-43-4万个万个 蛋白蛋白分子分子细菌或噬菌体、病毒细菌或噬菌体、病毒单个染色体中

31、所含单个染色体中所含的全部基因（的全部基因（DNADNA） C值（值（C-value）：在真核生物中，每种生物的单倍：在真核生物中，每种生物的单倍 体基因组的体基因组的DNA总量总是恒定的，称为总量总是恒定的，称为C-值值 【C-value is the quantity of DNA in the genome (per haploid set of chromosomes).】 C C是每种生物的一个特征，不同生物之间差别很大是每种生物的一个特征，不同生物之间差别很大低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物中变化很大中变化很大DN

32、A content of the haploid genome is related to the morphological complexity of lower eukaryotes, but varies extensively among the higher eukaryotes.之一之一： 物种之间形态学物种之间形态学的复杂性与的复杂性与C C值不成值不成正正相关相关 b b、亲缘关系相近的亲缘关系相近的生物大生物大C C值相差较大值相差较大之二之二：一种生物内大：一种生物内大C C值值与与 编码蛋白质的基因相编码蛋白质的基因相差极大差极大 (Euk.(Euk.人体人体 c =

33、C/10)c = C/10) (Prok. x174 c (Prok. x174 c C)C) C值矛盾（值矛盾（C-value paradox，C-悖理）悖理）：形态学的复杂程度与形态学的复杂程度与C-值不一致的现象值不一致的现象a a、生物进化程度与、生物进化程度与C C值的矛盾值的矛盾( (两栖类与两栖类与哺乳类哺乳类) ) C值悖理与表现值悖理与表现 第四节第四节 真核生物真核生物DNA序列类型序列类型一、高度重复序列一、高度重复序列（Highly repetitive sequenceHighly repetitive sequence）ProkaryoteProkaryoteEuk

34、aryoteEukaryote(GC%)42413455MOUSEMOUSE CALFCALFCsCl 离心离心 卫星卫星DNADNA（Satellite DNASatellite DNA） 由由2-20bp2-20bp组成组成重复单位串排列重复单位串排列分布于着丝点分布于着丝点, , 端粒区端粒区, , 结构基因结构基因 两侧两侧 heterochromatinheterochromatin果蝇（果蝇（Drosophila）卫星卫星DNASea crab2bpATATAT.Drosophila5bpATAATATAAT.Mouse9bpGAAAAATGAGAAAAATGA小卫星重复单位小于小

35、卫星重复单位小于25bp25bp，数目可变的串联重复或数目可变的串联重复或( Variable number tandem repeats . VNTR ) 小卫星小卫星Minisatellite DNA限制性内切核酸酶概念限制性内切核酸酶概念限制性内切酶可以将限制性内切酶可以将DNADNA剪切成特定的片段剪切成特定的片段使用不同的限制性内切使用不同的限制性内切酶，通过叠加法可用于酶，通过叠加法可用于DNADNA作图作图SouthernSouthern印记印记限制性片断长度多限制性片断长度多态性技术态性技术 (RFLP)(RFLP)第一代第一代DNADNA指纹技术指纹技术DNA指纹技术指纹技术

36、Hae切某一个体切某一个体DNA电泳电泳 (Electrophorese)与标记的小卫星与标记的小卫星DNADNA探针杂交探针杂交X X线胶片检测线胶片检测限制性片断长度多态性技术限制性片断长度多态性技术(RFLP)(RFLP) 第一代第一代DNADNA指纹技术指纹技术利用利用DNA分型（分型（DNA typing）辅助鉴定嫌疑犯）辅助鉴定嫌疑犯现场血迹现场血迹1234567 微卫星微卫星DNADNA（Microsatellite DNAMicrosatellite DNA）105-106 copies / genome微卫星重复单位为微卫星重复单位为26bp26bp，重复区域小于，重复区域小于150bp150bp 无选择压力无选择压力 （multiple allele multiple allele 可保留在群体中）可保留在群体中） （ 有效的分子标记，有效的分子标记， ）广泛用于基因定位的连锁分析、个体识别和亲