专题五 土壤微生物研究方法

1、专题四专题四 土壤土壤-微生物系统研究方法微生物系统研究方法 第一节第一节 土壤微生物研究概述土壤微生物研究概述 一、土壤微生物学的研究对象一、土壤微生物学的研究对象 土壤微生物多样性：土壤微生物多样性： 土壤微生物过程土壤微生物过程 土壤微生物与环境的关系土壤微生物与环境的关系 n （一）土壤微生物的物种多样性（一）土壤微生物的物种多样性 土壤微生物的功能多样性土壤微生物的功能多样性 土壤微生物的结构多样性土壤微生物的结构多样性 土壤微生物的遗传多样性土壤微生物的遗传多样性 1、土壤微生物功能多样性：、土壤微生物功能多样性： 指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，主指土壤生态系统中微生

2、物的物种丰富度和均一度，主要从分类学、系统学和生物地理学角度对一定地域内物种要从分类学、系统学和生物地理学角度对一定地域内物种的现状进行研究。的现状进行研究。 目前主要通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了目前主要通过培养基最大限度地培养各种菌落，由此了解土壤中可培养的微生物种群。解土壤中可培养的微生物种群。 2、土壤微生物的功能多样性、土壤微生物的功能多样性 指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程，对自然界元素循环具有重要意义的执行过程，对自然界元素循环具有重要意义 如：分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的如：分解功

3、能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的功能等。功能等。 目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微生物群落的代谢功能多样性。生物群落的代谢功能多样性。 3、土壤微生物结构多样性、土壤微生物结构多样性 指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因 4、土壤微生物的遗传多样性、土壤微生物的遗传多样性 是土壤微生物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗土壤微生物在基因水平上携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，这

4、是微生物多样性的本质和最终反映传信息的总和，这是微生物多样性的本质和最终反映（二）土壤微生物过程（二）土壤微生物过程 土壤微生物是土壤中物质转化的动力：土壤微生物是土壤中物质转化的动力： 如如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分 解和合成解和合成 土壤酶与微生物细胞一起推动物质转化土壤酶与微生物细胞一起推动物质转化 （三）土壤微生物与环境的关系（三）土壤微生物与环境的关系 如：全球变暖、森林锐减、土壤退化都与微生物如：全球变暖、森林锐减、土壤退化都与微生物 有关。有关。 二、土壤微生物研究方法进程二、土壤微生物研究方法进程 1676年，虎克用自

5、制的单式显微镜观察到细菌个体年，虎克用自制的单式显微镜观察到细菌个体 1897年，毕希纳用无细胞酵母菌压榨汁中的年，毕希纳用无细胞酵母菌压榨汁中的“酒花酶酒花酶” 对葡萄糖进行乙醇发酵成功，从而开创了微生物生对葡萄糖进行乙醇发酵成功，从而开创了微生物生 化研究的新时代化研究的新时代 1953年，沃森和克里克发表了关于年，沃森和克里克发表了关于DNA双螺旋模型，双螺旋模型， 整个生命科学领域进入分子生物学研究阶段，是微整个生命科学领域进入分子生物学研究阶段，是微 生物学发展史上成熟到来的标志。生物学发展史上成熟到来的标志。第二节第二节 土壤微生物的计数与分析土壤微生物的计数与分析 一、培养计数法

6、一、培养计数法 根据培养基上所生长微生物的数量来根据培养基上所生长微生物的数量来估算土壤中微生物的数量的方法估算土壤中微生物的数量的方法 稀释平板法稀释平板法 最大或然数法（最大或然数法（MPN稀释法）稀释法） 土粒法土粒法（一）一般微生物的分离与计数（一）一般微生物的分离与计数 稀释平板法：稀释平板法： 用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中

7、微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌落可以很好地分散开落可以很好地分散开最大或然数法（最大或然数法（MPN稀释法）稀释法） 用于一些特殊功能菌的计数，如，硝化细菌和反硝化细菌用于一些特殊功能菌的计数，如，硝化细菌和反硝化细菌 假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管中全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释在试管中全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释液中

8、微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物，根据没有出现细菌的最低稀释很少出现微生物，根据没有出现细菌的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度计算土壤中微生物的度和出现菌落的最高稀释度计算土壤中微生物的数量。数量。稀释度稀释度10-110-210-310-410-5生长情况生长情况 +-+-读数读数55420该系列稀释中，所有重复都有生长的最高稀释度的数量该系列稀释中，所有重复都有生长的最高稀释度的数量指标是指标是5（10-2），出现菌落的最低稀释度指标是），出现菌落的最低稀释度指标是2（10-4），则该例

9、的数量指标为），则该例的数量指标为542，查重复为，查重复为5稀释法稀释法测数统计表得近似值为测数统计表得近似值为25gMPN /，单位干土重鲜土重数量指标首位稀释倍数近似值菌落稀释度稀释度10-110-210-310-410-5生长情况生长情况 +-+-+-读数读数54220 该系列稀释中，所有重复都有生长的稀释度是该系列稀释中，所有重复都有生长的稀释度是10-1，指标，指标是是5，后面还有三个稀释度有数字，则将数量指标最后一，后面还有三个稀释度有数字，则将数量指标最后一个数字（个数字（2）加到前一个数字（）加到前一个数字（2）即）即544，由表查得近似，由表查得近似值为值为35gMPN /

10、，单位干土重鲜土重数量指标首位稀释倍数近似值菌落如果在所有试管都有微生物生长的稀释度后仍有三个数字如果在所有试管都有微生物生长的稀释度后仍有三个数字，土粒法土粒法 该法是将供试土壤颗粒，排列在适于某该法是将供试土壤颗粒，排列在适于某一生理类群微生物生长的选择性固体培一生理类群微生物生长的选择性固体培养基上，这一类微生物的菌落围绕着颗养基上，这一类微生物的菌落围绕着颗粒发育起来，由这些颗粒在试样中所占粒发育起来，由这些颗粒在试样中所占的百分数可以得到这类菌在土壤中的含的百分数可以得到这类菌在土壤中的含量及其近似值。量及其近似值。（二）、厌氧微生物的分离与计数（二）、厌氧微生物的分离与计数 充氮厌

11、氧培养法充氮厌氧培养法 用真空泵抽去真空干燥器中的空气，用用真空泵抽去真空干燥器中的空气，用N2、CO2H 或或H2代替。在真空干燥器中培养严格厌氧细菌，可代替。在真空干燥器中培养严格厌氧细菌，可 得表面菌落。得表面菌落。 焦性没食子酸吸氧法焦性没食子酸吸氧法 利用焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收游离氧来创造利用焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收游离氧来创造厌氧环境。厌氧环境。二、土壤微生物生物量的测定二、土壤微生物生物量的测定 氯仿熏蒸法氯仿熏蒸法 根据熏蒸和未熏蒸土壤释放的根据熏蒸和未熏蒸土壤释放的CO2的量计算生物量。的量计算生物量。 底物诱导呼吸法底物诱导呼吸法 在土壤中加入容易分解的底物进

12、行培养，根据在土壤中加入容易分解的底物进行培养，根据CO2释释放量计算。放量计算。 腺苷三磷酸测定法腺苷三磷酸测定法 通过测定土壤中通过测定土壤中ATP的量测定土壤微生物量的量测定土壤微生物量第三节 土壤微生物多样性分析 土壤微生物多样性是指土壤生态系土壤微生物多样性是指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度统中微生物的物种丰富度和均一度,是是调节和维护土壤生态系统功能的关键调节和维护土壤生态系统功能的关键因素。她包括微生物群落多样性、结因素。她包括微生物群落多样性、结构多样性及遗传多样性。构多样性及遗传多样性。研究方法研究方法 基于培养和分离手段来揭示土壤微生物的群基于培养和分离手段来揭示

13、土壤微生物的群落变化。落变化。 基于生物指示分子（如磷脂脂肪酸、基于生物指示分子（如磷脂脂肪酸、DNA及及RNA）变异模式的土壤微生物多样性）变异模式的土壤微生物多样性一、微生物功能多样性研究方法一、微生物功能多样性研究方法 指土壤微生物群落所能执行指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行的功能范围以及这些功能的执行过程，如分解功能、营养传递功过程，如分解功能、营养传递功能等能等BIOLOG碳素利用法：碳素利用法： 是由美国是由美国BIOLOG公司于公司于1989年开发成功，最初应用年开发成功，最初应用于纯种微生物的鉴定，于纯种微生物的鉴定，1991年开始应用于土壤微生物群年开始应

14、用于土壤微生物群落功能多样性研究，目前以使用落功能多样性研究，目前以使用BIOLOG ECO（生态板）（生态板）板最为实惠而受欢迎。板最为实惠而受欢迎。基本原理：基本原理： 土壤微生物细胞利用土壤微生物细胞利用31种碳源进行代种碳源进行代谢，以代谢过程产生的酶与四唑类显谢，以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质（如色物质（如TTC、TV）发生颜色反应）发生颜色反应的浊度差异为基础，运用独有的显性的浊度差异为基础，运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱，反映不同环境条件引起的指纹图谱，反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化土壤微生物群落变化 BIOL

15、OG 测试板含有测试板含有96个小孔，除对照外，个小孔，除对照外，其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂，通过接种菌悬液，根据微生物对碳源利用剂，通过接种菌悬液，根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性多样性该法优点该法优点灵敏度高、分辨力强灵敏度高、分辨力强无需分离培养纯种微生物，可以最大限度地无需分离培养纯种微生物，可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征保留微生物群落原有的代谢特征测定简便，数据读取与记录可以由计算机辅测定简便，数据读取与记录可以由计算机辅助完成助完成可以连续监

16、测微生物的变化，可批量分析可以连续监测微生物的变化，可批量分析该法缺点该法缺点特别依赖于群体生理活性，不能监测休眠体，特别依赖于群体生理活性，不能监测休眠体，也不能检测那些不能利用也不能检测那些不能利用BIOLOG碳源底物的碳源底物的群体；群体；如果不能很好地解释一个区系中微生物种类如果不能很好地解释一个区系中微生物种类的相互作用如何影响底物的利用情况，很难把的相互作用如何影响底物的利用情况，很难把这些变化同种类变化联系起来；这些变化同种类变化联系起来；测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能中的代谢活性，因此，也不能

17、确定它的结果能否反映土壤区系的实际代谢情况；否反映土壤区系的实际代谢情况；二、土壤微生物结构多样性分析二、土壤微生物结构多样性分析 磷脂脂肪酸法也称为磷脂脂肪酸法也称为PLEA法法 （phospholipid fatty acid 法）；法）； 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。基本原理基本原理 PLEA是构成活体生物细胞膜的重要组分，不是构成活体生物细胞

18、膜的重要组分，不同类群微生物能通过相应生化途径形成特定同类群微生物能通过相应生化途径形成特定的的PLEA，使部分，使部分PLEA总是出现在同一类群总是出现在同一类群的卫生中，作为区分活体微生物群落生物标的卫生中，作为区分活体微生物群落生物标记的基础。以此根据脂肪酸的种类及组分比记的基础。以此根据脂肪酸的种类及组分比例可鉴别土壤微生物群落结构的多样性变化。例可鉴别土壤微生物群落结构的多样性变化。该法的缺点该法的缺点 很难从种的水平鉴定微生物类群，只能鉴定到属很难从种的水平鉴定微生物类群，只能鉴定到属 该法依赖于标记脂肪酸，该法依赖于标记脂肪酸， PLEA的组成和浓度可能的组成和浓度可能受土壤微生

19、物生长发育及其外界环境的影响，难受土壤微生物生长发育及其外界环境的影响，难以区别死与活的微生物，给微生物群落结构的定以区别死与活的微生物，给微生物群落结构的定性和定量分析带来了一定困难。性和定量分析带来了一定困难。 土壤中土壤中PLEA标记物的组成及其稳定性受提取方法、标记物的组成及其稳定性受提取方法、提取条件等因素直接影响提取条件等因素直接影响三、土壤微生物遗传多样性的分析三、土壤微生物遗传多样性的分析 指土壤微生物在基因水平所携指土壤微生物在基因水平所携带的各类遗传物质和遗传信息带的各类遗传物质和遗传信息的综合，是微生物多样性的本的综合，是微生物多样性的本质和最终反映质和最终反映 基于杂交

20、的分析方法基于杂交的分析方法(fish技术技术) 基于基于PCR（聚合酶链反应，（聚合酶链反应，polymerase chain reaction ）的分析方法）的分析方法基于基于PCR（聚合酶链反应，（聚合酶链反应，polymerase chain reaction ）的分析方法）的分析方法 土壤土壤DNA提取与纯化提取与纯化 PCR：PCR能快速特性性扩增任何已知序列，并能将能快速特性性扩增任何已知序列，并能将pg水平的水平的DNA混合物中的目的基因扩增到混合物中的目的基因扩增到ng、ug、mg级的级的特异性片段特异性片段 变性处理和分析检测：电泳和酶切变性处理和分析检测：电泳和酶切海南福

21、山香蕉园土壤微生物多样性分析过程海南福山香蕉园土壤微生物多样性分析过程 16S rRNA基因扩增基因扩增 转化宿主转化宿主 构建构建16S rRNA基因文库基因文库 HhaI酶切酶切 构建系统发育树构建系统发育树. .香蕉地土壤细菌种类多样性分析流程香蕉地土壤细菌种类多样性分析流程总总DNA的提取的提取阳性克隆子进行菌落阳性克隆子进行菌落PCR 挑选测序、挑选测序、Blast分析分析多样性分析多样性分析 16S rRNA基因扩增基因扩增 转化宿主转化宿主 构建构建16S rRNA基因文库基因文库 HhaI酶切酶切 构建系统发育树构建系统发育树4.4.香蕉地土壤细菌种类多样性分析香蕉地土壤细菌种

22、类多样性分析总总DNA的提取的提取阳性克隆子进行菌落阳性克隆子进行菌落PCR 挑选测序、挑选测序、Blast分析分析多样性分析多样性分析（1）库容coverage C文库的库容计算：isiippHln1NnC11（2）ShannonWiener指数的计算（3）物种均匀度指数的计算公式MaxHHE （4）物种优势度Simpson指数的计算公式 siipD121（5）物种丰富度Margalef指数的计算公式NSdln1max多样性指数计算多样性指数计算香蕉园土壤真菌种类多样性分析 香蕉园土壤总DNA进行ITS片段扩增 筛选阳性克隆子进行菌落PCR 选择克隆子测序并比对，构建系统进化树 测得序列提交

23、GeneBank香蕉根际土壤样品的香蕉根际土壤样品的DNA含量和含量和DNA纯度比较纯度比较土壤样品土壤样品DNADNA纯度纯度浓度浓度g/mlg/ml干土干土gDNA/ggDNA/gODOD260260/OD/OD230230ODOD260260/OD/OD280280发病蕉园发病蕉园 直接法直接法1.571.571.761.760.0960.0960.960.96 间接法间接法1.401.401.691.690.2560.2560.510.51健康蕉园健康蕉园 直接法直接法1.631.631.641.640.0880.0880.880.88 间接法间接法1.481.481.781.780.

24、2110.2110.420.42香蕉地土壤细菌种类多样性香蕉地土壤细菌种类多样性 图图4 4 土壤总土壤总DNA的的16S rDNA扩增结扩增结果果本研究采用的本研究采用的PCR循环次数是循环次数是15次，同时做次，同时做10管，将管，将PCR 产物产物回收后混合均匀，减少回收后混合均匀，减少PCRPCR偏向性偏向性的影响，以保证所构建的文库准的影响，以保证所构建的文库准确。确。香蕉地土壤总香蕉地土壤总DNA16SrDNA16SrDNA片段扩增片段扩增香蕉园土壤微生物多样性参数香蕉园土壤微生物多样性参数表表3 3 土样土样16SrDNA文库的微生物多样性参数文库的微生物多样性参数文库文库RFL

25、PRFLP库容库容香农香农-维纳指数维纳指数均匀度指数均匀度指数优势度指数优势度指数丰富度指数丰富度指数编号编号类型类型C CH HE ED Dd dmaxmax发病蕉园发病蕉园212196%96%1.711.710.560.560.970.974.344.34健康蕉园健康蕉园474793.5%93.5%3.593.590.930.930.920.928.878.87测序结果比对分析测序结果比对分析表表4 4 发病香蕉园土壤发病香蕉园土壤16S rDNA文库部分克隆子测序分析文库部分克隆子测序分析编号编号所属物种所属物种E E值值同源性同源性所属门所属门D1B5D1B5Streptomyces

26、Streptomyces sp. sp.（链霉菌属）（链霉菌属）0.00.0100%100%放线菌门放线菌门D1B7D1B7NitrospiraNitrospira sp. sp.（硝化螺菌属）（硝化螺菌属）0.00.096%96%硝化螺旋菌门硝化螺旋菌门D1B11D1B11Uncultured Acidobacteria Uncultured Acidobacteria bacteriumbacterium0.00.097%97%未培养酸杆菌门未培养酸杆菌门D1B17D1B17 AcidobacteriumAcidobacterium sp. sp. （酸杆菌属）（酸杆菌属）0.00.094

27、%94%酸杆菌门酸杆菌门D1B19D1B19Uncultured prokaryoteUncultured prokaryote0.00.094%94%未培养原核生物未培养原核生物D1B24D1B24 Chloroflexus Chloroflexus sp.sp.（绿弯菌属）（绿弯菌属）0.00.095%95%绿屈挠菌门绿屈挠菌门D1B31D1B31ClostridiumClostridium sp. sp. （梭菌属）（梭菌属）0.00.099%99%厚壁菌门厚壁菌门发病香蕉园病土壤发病香蕉园病土壤16S rDNA文库的克隆子有文库的克隆子有6 6个属，个属，大约有大约有29%属于厚壁菌门

28、，属于厚壁菌门，22%属于放线菌门，还有少属于放线菌门，还有少部分属于硝化螺旋菌门、酸杆菌门、绿屈挠菌门等部分属于硝化螺旋菌门、酸杆菌门、绿屈挠菌门等。编号编号所属种属所属种属E E值值同源性同源性所属门所属门D2B006D2B006Streptomyces sp. （链霉菌属）（链霉菌属）0.00.0100%100%放线菌门放线菌门D2B007D2B007Oscillatoria sp. （颤藻属）（颤藻属）0.00.099%99%蓝藻门蓝藻门D2B011D2B011Clostridium sp.（梭菌属梭菌属）0.00.094%94%厚壁菌门厚壁菌门D2B015D2B015Azospiri

29、llum sp. （固氮螺菌属）（固氮螺菌属）0.00.087%87%-变形菌纲变形菌纲D2B016D2B016Sphingomonas sp.（鞘脂单胞菌属（鞘脂单胞菌属）0.00.097%97%-变形菌纲变形菌纲D2B022D2B022Clostridium sp.（梭菌属）（梭菌属）0.00.094%94%厚壁菌门厚壁菌门D2B027D2B027Nitrospira sp.（硝化螺菌属）（硝化螺菌属）0.00.096%96%硝化螺旋菌门硝化螺旋菌门D2B056D2B056Enterobacter sp.（肠杆菌属）（肠杆菌属）0.00.099%99%-变形菌纲变形菌纲D2B064D2B0

30、64Acinetobacter sp.（不动杆菌属）（不动杆菌属）0.00.0100%100%-变形菌纲变形菌纲D2B075D2B075Bacillus sp.（芽孢杆菌属）（芽孢杆菌属）0.00.091%91%厚壁菌门厚壁菌门D2B101D2B101Sinorhizobium sp.（中华根瘤菌属）（中华根瘤菌属）0.00.088%88%-变形菌纲变形菌纲D2B121D2B121Acidobacteriales sp.sp.（酸杆菌属）（酸杆菌属）0.00.097%97%酸杆菌门酸杆菌门D2B154D2B154Lysinibacillus sp. . （属（属芽孢杆菌科芽孢杆菌科）0.00.

31、099%99%厚壁菌门厚壁菌门D2B165D2B165Dokdonella sp.（属（属黄色单胞菌科黄色单胞菌科）0.00.098%98%-变形菌纲变形菌纲表表5 健康香蕉园土壤健康香蕉园土壤16S rDNA文库部分克隆子测序分析文库部分克隆子测序分析健康香蕉园土壤健康香蕉园土壤16S rDNA文库的克隆子中有文库的克隆子中有1414个属，变个属，变形菌门占形菌门占42%42%，厚壁菌门占，厚壁菌门占26%26%，放线菌门占，放线菌门占11%11%，酸杆菌，酸杆菌门占门占6%6%，还有蓝藻门、硝化螺旋菌门等，还有蓝藻门、硝化螺旋菌门等，图图6 6 基于基于16SrDNA16SrDNA序列的发

32、病香蕉园土壤细菌系统发育树序列的发病香蕉园土壤细菌系统发育树B图图6 6 基于基于16SrDNA16SrDNA序列的健康香蕉园土壤细菌系统发育树序列的健康香蕉园土壤细菌系统发育树B香蕉地土壤真菌种类多样性香蕉地土壤真菌种类多样性图图7 土壤总土壤总DNA的的ITS扩增结果扩增结果香蕉地土样总香蕉地土样总DNA的的ITS序列扩增序列扩增编号编号所属种属所属种属E E值值同源性同源性D1I1Fusarium sp. ( (镰刀菌属镰刀菌属) )0.00.099%99%D1I2Stenella musicola( (疣丝孢疣丝孢属属) )0.00.095%95%D1I14Dioscorea polystachya( (薯蓣属薯蓣属) )0.00.090%90%D1I16Cladosporium musae( (枝孢属枝孢属) )0.00.099%99%D1I20Urostyla grandis( (尾尾枝