各种实验操作

1、实验题目：光学显微镜技术 实验类型：基本技术 学 时：6 一、实验目的了解体式显微镜、生物显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光倒置显微镜和干涉差显微镜的构造原理，并掌握其使用方法。二、试剂和器材体式显微镜、生物显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光倒置显微镜、干涉差显微镜、载玻片、盖玻片、乙醇、香柏油、二甲苯、滤纸条、醋酸、磷酸二氢钾、染色缸、永久制片等。三、实验内容1.体视显微镜的构造与使用方法2.生物显微镜的构造与使用方法3.暗视野显微镜的构造与使用方法4.相差显微镜的构造与使用方法5.荧光倒置显微镜的构造与使用方法6.干涉差显微镜的构造与使用方法四、关键步骤与注意事项1. 镜头上更多的

2、较顽固的污迹要用干净的软棉布，镜头纸或纱布蘸上无水乙醇或甲醇轻轻地擦去。2. 从油镜上擦去浸油，应使用镜头纸、软棉布或纱布，蘸上二甲苯轻轻擦去。3. 使用100X物镜时，标本与物镜之间充满显微镜用油；用40X、100X甘油荧光镜时，应在物镜与标本之间充满甘油。五、思考题 1.物镜的种类各具有何种特点?2.柯勒照明法及其实质?3.显微镜的各种能力之间有何关系?4.为什么暗视野照明的视场暗黑，样品影像明亮?5.使用暗视野照明时，为什么必须在聚光器与载玻片间进行油浸?6.如何进行暗视野聚光器的调中和聚焦?7.相差显微镜有哪些特有的附件，其构造如何? 8.为什么相差显微镜可以直接观察活体样品?9.干涉

3、显微镜适用观察哪种标本?10.荧光显微镜为什么要以汞灯当光源?11.激发滤片和阻断滤片的功能及其区别?实验题目：离心技术 实验类型：基本技术 学时： 4一、仪器设备 低速离心机、低速冷冻离心机、高速离心机、高速冷冻离心机、落地式大容量冷冻离心机。二、仪器结构 略三、原 理 在离心力场的作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度。四、适用范围 微生物菌体、大分子蛋白质、酶反应液或各种提取液，常常是由固相（固形物）与液相组成的悬浮液。五、操作方法 1、 接通离心机电源，打开机器开关，等待机器自检完毕；2、 按open键（机器电子锁开），打开机器盖；3、 根据使用需要选择合适的转子，将转子轻轻地

4、套在旋转轴上，用六角螺丝刀旋转转子上的螺母，将转子固定。4、 根据转子选择适合的离心管，将样品装入一对离心管后，在托盘天平上调节使它们质量相等，然后对称的放入转子中，先将转子的盖子旋紧，然后盖上机器盖。5、 根据需要依次设置离心所需要的温度、运行程序（可不选择）、转速、离心时间（当触及某一项的按键时，显示屏上相对应的值会闪烁，设完一个参数可直接触及下一个按键，继续设定所需数值），设置结束后按“start/stop”开始运行机器。6、 离心结束后，转子会逐渐地停下来，“open”键指示灯亮起，按此键打开离心室，旋开转子盖，取出样品。7、 将离心管处理干净，倒置在小张滤纸上使其干燥，以便下次使用。

5、旋上转子盖，关上机盖。若离心室内壁有冰霜待其化净干燥后，再旋上转子盖，关上机盖。六、注意事项1、  离心机移动后，最好4小时后再使用。转子长期不使用，应取出。使用时在旋转上涂抹润滑油。2、 使用离心机时对称放置离心管，且质量相等。机器运行前检查转子盖、机器盖是否盖好。七、思考题 1、离心机适用范围如何？2、使用离心机时应该注意哪些？实验题目：光谱分析技术实验类型：基本技术 学 时：6一、仪器设备 721、723可见分光光度计、752紫外可见分光光度计、UV2401PC紫外可见分光光度计、UV3150PC紫外可见近红外分光光度计、RF-5301PC荧光分光光度计、比色液及标准溶液、滤纸

6、等。二、仪器结构 略三、原理光谱仪器是一种简单易用的分光光度法测定通用仪器，不同型号的机器测定的波长范围不同，可以根据自己的需要选择要使用的仪器。不同型号的光谱仪器的构造有很大的差别，但是其基本原理是相同的。根据溶液中各种成分对透过光的吸光度不同，在一定范围内，吸光值（或者透过率）与溶质的浓度成正比（玻尔定律）。通过准确浓度的标准品对应其吸光值（透过率）作图，可以得到一条标准曲线。测定未知浓度的待测样品的吸光值（透过率），与标准曲线相比较就可以得到其浓度。四、适用范围可广泛用于医学卫生、临床检测、生物化学、石油化工、环保检测、质量控制等方面作定量、定性分析。具体可以对多糖、蛋白、核酸等物质进行

7、定性、定量测量。同时UV3150PC紫外可见近红外分光光度计还可以测量近红外区的固体、液体样品的吸收光谱，RF-5301PC荧光分光光度计可以测定荧光物质的发光强度光谱，同时他们自带的软件可以方便的进行数据处理与分析。五、操作步骤 略六、注意事项1、  光度计灯源寿命有限，若长时间不测量，应通过UVProbe软件断开连接（点击“Disconnect”），然后关闭光度计电源。2、  使用分光光度计时要保证样品室绝对干净，小心放入样品，放入前比色皿一定要先用滤纸和擦镜纸将比色皿外表面擦干净，不要污染样品池和光度计外表面。3、  仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖

8、。4、  软件不会自动保存数据，所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“Save As”进行另存。否则数据会丢失。5、  认真填写贵重仪器使用记录。七、思考题1干扰测定结果的因素有哪些？2为了更好的维护和保养仪器，在使用的过程中应该注意哪些方面？实验题目：层析技术 实验类型：基本技术 学时：8一、仪器设备 紫外检测仪、蠕动泵、记录仪、ATK层析系统、层析柜、树脂、样品等。二、仪器结构 略三、原理 由于填料的不同，各个实验室所使用的层析技术的原理也不完全相同。但不外乎以下几种基本原理：分子筛作用、离子交换作用、亲和层析作用等等。分子筛作用是由于填料上有一定规格的孔径，分子

9、量大小不一样的样品流过柱子时所受到的作用力不一样，所走的路径也不同，所以流出柱子的时间也就有了差异，不同组分得以分开。离子交换是由于正负电荷的吸引而使样品挂在填料上，改变溶液环境，使样品分子所带的电荷产生变化，从而被洗脱下来，不同组分与柱料的吸附作用力时不同的，从而洗脱条件也是不同的。亲和层析就是柱料与被分离样品特异性的吸附结合一起，从而使被分离物质与其他成份分离开来。四、适用范围1蛋白质分子量的测定2蛋白质的分离纯化3多糖的分子量测定4多糖的分离纯化五、操作步骤1柱料的前处理2选择合适直径与长度的层析柱，装柱3装完柱之后就连上紫外检测器，检验260nm处的吸光值4用上样缓冲液平衡柱子5将样品

10、液浓缩后上样6洗脱液洗脱，部分收集器收集各个组分7分别测定各个组分的浓度和含量；合并活力峰六、注意事项1柱料前处理一定要彻底，完全，将杂质全部除去。2上样之前柱子平衡要过夜。3分子筛层析时点样量不能过大，柱面一定要平。4上样、洗脱时一定要对目标产物跟踪去向。七、思考题1分子筛层析、离子交换层析样品在流经柱子的时候都受到哪些力的作用？2分子筛层析、离子交换层析对柱料前处理、上样和洗脱的要求有何不同？3如果两种组分分离不开，试解释其可能的原因？4上样之前如果不进行平衡，会对结果产生什么影响？实验题目：电泳技术 实验类型：基本技术 学时：4一、仪器设备 等电聚焦电泳、梯度电泳、纸上电泳、醋酸纤维薄膜

11、电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等所需的电泳仪、电泳槽、制胶模具和所需试剂等。二、仪器结构 略三、原理 电泳就是带电荷的样品在电场力的作用下，因不同的迁移行为而彼此得以分离的方法。根据其载体介质的不同可以分为等电聚焦电泳、梯度电泳、纸上电泳、醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构所在介质的pH和组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也有差异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。在电泳的过程中药品会受到电场力、分

12、子筛作用、静电吸附作用、共价结合作用等等方面的作用力。药品在这些作用力的综合作用下，泳动的速度产生差异，从而将不同的组分分离开来。电泳的介质不同，则电泳的功能也不大相同，其所最适用的方向也是不一样的，最终检测的指标也是不一样的。等电聚焦电泳常用于测定蛋白质的等电点，他最后测定的指标就是pH值。琼脂糖凝胶电泳最常应用于核酸的检测，最后是以分子量的大小来衡量电泳结果。四、适用范围a)        主要应用于分离各种有机物（氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）。b)    

13、;    可用于分析物质的纯度。c)        用于测定相对分子量。d)        与层析连用可用于蛋白质结构分析。五、操作步骤1配制胶并且将电泳装置连接好。2点样，点样量大小要合适。3选择合适的电压进行电泳。4染色或者处理凝胶，检验电泳结果。六、注意事项1要选择合适的点样量。2选择合适的电压或者电流，并设定合适的程序。七、思考题1电泳结果不好可能有哪些方面的原因？2电泳时的电压根据什么作出选择的？实验题目： 高效液相

14、色谱技术 实验类型： 基本技术 学 时：6 一、仪器设备 HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等。现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。二、仪器结构 12487双通道紫外检测器：2Waters 600色谱泵三、原 理色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过流动相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、

15、亲和）的大小、强弱不同，在流动相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。四、使用范围高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发、低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。五、操作步骤 1 600泵的操作步骤A对泵

16、进行冲洗后，关闭流量，注意流速必须要逐步变化。B 如果使用有缓冲液的流动相，则停泵前一定要用HPLC级纯水清洗HPLC系统。C 同时用清水清洗柱塞杆。 D若停泵存放时间超过一天，则停泵前还需用水/甲醇清洗系统。2. 2487检测器的操作步骤a. 开机 检查2487的电路，流路已正确连接。如较长时间未用, 开机前用HPLC级甲醇(已经过滤和脱气)用1ml/min 流速冲洗至少15分钟。 接通电源开关。 LCD面板显示一系列自检过程，约7分钟。 通过自检后显示吸光度主屏幕。b. 单/双波长方式的设定当2487在Stand alone模式下运行时，可通过面板键盘选择其单/双波长检测方式2487的预设

17、方式是单波长方式,在主屏幕下,按(Shift +Autozero)键可在 单/双波长方式间切换,并被检测器记忆存储,下次开机时,2487会显示上次关机时的设置,主屏幕右侧会出现一个或标记,分别表示检测器已处在单或双波长方式下。在主屏幕下可用A/B键切换通道,分别观看A或B通道的吸光度检测值，并可分别键入波长和灵敏度数值,以及其它参数。c. 关灯为节省灯的使用寿命,可在2487不关机的情况下,只把灯关闭 (Waters 建议:只是在关灯时间超过4小时以上时才需要实施关灯操作,因为频繁开关灯,同样会有损灯的寿命)按Lamp(Shift,1)键,出现一个灯控制屏幕。再按一次Lamp(Shift,1)

18、键,即将灯关闭,显示屏上会出现灯关闭的信息和图示。d. 关机关机前需保证流动池内无缓冲盐，用100%水冲洗，以洗去缓冲盐。再用90:10的甲醇/水，冲洗系统，并将系统保存在该流动相中。将面板右下角的电源开关扳到off, 即将2487检测器关闭。六、注意事项1柱的使用和维护注意事项 A 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。B  选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。C     避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接

19、一保护柱。 D 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。 E 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 F 每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔45天开机冲洗15分钟。2泵的使用和维护注意事项 为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：  防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、 缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应

20、保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。七、思考题1 色谱分析的基本原理是什么？2 何谓流动相，固定相？3 任何样品都能用液相色谱法分析吗？实验题目：消毒、灭菌与无菌操作技术 实验类型：基本技术 学 时：6 一、仪器设备手提式高压灭菌锅、立式高压灭菌锅、全自动高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、无菌室、酒精灯、滤菌过滤器二、仪器

21、结构 灭菌器：安全阀 压力表 放气阀 软管 紧固螺栓 灭菌桶 筛架 水（各种型号的结构有些不同，但是原理是一样的） 超净工作台：开关 风力调节器 灯开关 烘箱：电源开关 设温旋钮 显示屏三、原理1 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。2 湿热灭菌是物品放入密闭的加压灭菌锅内加热，产生蒸汽，排除冷空气后密闭，使蒸汽不溢出，增大压强，使水的沸点升高，高于100，导致菌体蛋白质凝固变性达到目的。3 过滤除菌主要是选用孔径小的微孔材料制作成专门的细菌滤器，通过减压过滤，达到除菌。4 紫外线灭菌是指在波长200nm-300nm之间，紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链

22、的交联，从而抑制了DNA的复制达到灭菌。另外，由于辐射使空气中的氧电离成氧离子，氧离子再把氧气氧化成臭氧或使水被氧化为双氧水，臭氧和双氧水都有杀菌的作用。5 化学药品灭菌是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的。四、适用范围适用于任何无菌操作的实验。如：细胞传代培养、植物组织培养、细菌接种、微生物的分离纯化等各种高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌的原理和操作技术；无菌室、超净工作台的使用和在酒精灯火焰旁接种技术。五、操作步骤各种高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌的原理和操作技术；无菌室、超净工作台的使用和在酒精灯火焰旁接种技术六、注意事项高压蒸汽灭菌开始前要把冷空气排尽，灭菌后要待压力

23、降到“0”时才打开排气阀；烘箱灭菌要注意被灭菌物的灭菌温度；紫外线灭菌不要让紫外线照射人的皮肤；无菌室要定期用甲醛蒸汽熏蒸。七、思考题1.为什么灭菌器内需要灭菌的物品不能摆的太密？2.干燥箱灭菌的温度是多少？灭菌结束后要注意什么？3.比较干燥箱灭菌和高压灭菌器灭菌的优缺点，并说出原因。实验题目：培养技术 实验类型：基本技术 学 时：4 一、仪器设备恒温培养箱、光照培养箱、CO2培养箱、气浴恒温振荡器、水浴恒温振荡器、全自动发酵罐二、仪器结构 培养箱：电源开关 设温旋钮 显示屏（各种型号有所不同） 光照培养箱：电源开关 设温旋钮 光照旋纽 程序调节旋纽 显示屏 水浴、气浴振荡器：电源开关 设温旋

24、钮 转速调节旋钮 显示屏三、原理 培养箱可以维持恒定的温度，光照培养箱可以按照程序循环来模拟气候变化，气浴和水浴可以调节转速，使培养在液体培养基中的微生物或细胞生长。四、适用范围适用于任何需要恒温、变温的培养。如微生物分离、纯化、培养，动物细胞传代培养等。五、操作步骤恒温培养箱、光照培养箱、CO2培养箱、气浴恒温振荡器、水浴恒温振荡器、全自动发酵罐等结构及使用方法。六、注意事项培养时控制好温度，光照培养箱还要控制好光照强度、湿度；培养细胞及微生物时要无菌操作；水浴振荡器使用前必需加水，使用过程中要检查是否有水。七、思考题1.使用培养箱时应注意什么？2.二氧化碳培养箱的使用注意事项是什么？3.全

25、自动发酵罐的工作原理是什么？使用时应注意哪些方面。实验题目：徒手切片技术 实验类型：基本技术 学 时： 4 一、实验目的掌握徒手切片技术；熟悉在显微镜下植物组织结构的观察二、实验原理徒手切片法是用手直接握住小刀片，把选用的待观察的生物组织或器官切成薄片，以便于在显微镜下观察。该制片法简单易行，可及时观察到活体组织的结构与颜色。实验教学中，通常选用的植物材料作形态解剖观察时，适于以徒手切片法将组织制成玻片标本。待手切片的局限性在于难以把过干硬或柔软的材料制成薄片，对需制作连续切片厚度在几个微米的要求时，徒手切片更是无能为力。三、试剂与器材 烧杯、盖玻片、载玻片、解剖针、刀片、毛笔、显微镜等四、实

26、验内容取材切片选片固定与染色脱水透明封片五、关键步骤与注意事项1.切片时，切片和材料上都应不时地沾上水；动作要均匀有力，一刀切下，不得拉割或中途停顿。2. 封片时，载玻片、盖玻片必须清洗干净；树胶滴加要适量，以盖玻片盖上时树胶刚好扩散至其边缘为宜；树胶浓度也要适当，要既有一定的粘稠度又不能过于浓，可以在盖玻片下缓缓散开为宜。六、思考题1徒手切片显微镜观察的关键步骤是什么?2在徒手切片时要注意哪些事项?实验题目：常用培养基的制备、灭菌与消毒 实验类型：综合 学 时： 6 一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌

27、及过滤除菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。三、试剂与器材1.器材： 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸

28、、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、 电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2.试剂： 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1.称量溶化调pH过滤分装加塞包扎灭菌无菌检查2.干热灭菌：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物3.高压蒸汽灭菌：加水装物品加盖加热排冷空气加压恒压降压回零排汽取物无菌检查4.过滤除菌：组装灭菌连接压滤无菌检查清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。2.调pH不要过头。3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，时间到时降压至零取物。5.过滤除菌

29、要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。 六、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么?4.培养基的配制原则是什么?实验题目：土壤中微生物分离纯化培养 实验类型：综合 学 时： 8 一、实验目的掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微

30、生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀释涂布平板法步骤：倒平板制备土壤污水稀释液涂布培养挑菌落平板划线法步骤：倒平板标记培养基名称划线三、试剂与器材 1.器材 盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基四、实验内容1.土壤稀释液的制备 2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术五、关键步骤及注意事项1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。2.平

31、板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。 六、思考题1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。2.如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。实验题目：菌种保藏 实验类型：综合 学 时：6 一、实验目的1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。二、实验原理 微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法。三、试剂与器材1.材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌2.试剂 液体石

32、蜡、甘油、五氧化二磷、95乙醇、10盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰3.器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5×1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(30)、超低温冰箱和液氮罐等。四、实验内容1.斜面保藏法2.液体石蜡法3.穿刺保藏法4.砂土管保藏法5.冷冻真空干燥保存法五、关键步骤及注意事项1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。2.熔封安瓶时防止封闭不严。3.液氮冻存操作应防止冻伤。六、思考题根据实验谈谈1-2种菌种保藏方法的利弊?实验题目：细菌形态观察及单染

33、色 实验类型：基础 学 时：4 一、实验目的1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。4.初步认识细菌的形态特征。二、实验原理 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。三、试剂与器材 1.材料 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 2.试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵

34、结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。3.器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。四、实验内容简单染色法：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检五、关键步骤及注意事项1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀。2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。六、思考题1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环币?2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?实验题目：放线菌及霉菌形态观察 实验类型：基础 学 时：4 一、实验目的1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。2.学习并掌握

35、观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。二、实验原理 放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖

36、菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。三、试剂与器材 1.材料 黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏I号琼脂和

37、灭菌的查氏培养基。2.实验器材 经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。四、实验内容倒平板接种插片培养镜检五、关键步骤及注意事项1.倒平板要厚一些，接种时划线要密。2.插片时要有一定角度并与划线垂直。3.观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。 4.如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。 六、思考题1.镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?2.你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？实验题目：革兰氏染色及芽孢染色 实验类型：基础 学 时：4 一、实验目的1.了解革兰氏染色法和芽孢染色法

38、的原理，并掌握其操作方法。 2.了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。 3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。 4.学习显微镜(油镜)的使用方法。 5.初步认识细菌的形态特征。二、实验原理 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。芽孢染色法的基本原理，用着色力强的

39、染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。三、试剂与器材1.材料：枯草芽孢杆菌1218h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物 2.试剂革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95乙醇、番红液)。5孔雀绿水溶液 3.实验器材小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。四、实验内容1.革兰氏

40、染色法 制片初染媒染脱色复染镜检。2.Schaefer-Fulton氏染色法 制片染色水洗复染水洗镜检。五、关键步骤及注意事项 1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。六、思考题1.要得到正确的改良的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪一步?为什么? 2.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。3.你的染色结果是否正确?如果不正确，请说明原因。4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，

41、你认为这是什么原因?5.说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?实验题目：酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 实验类型： 基础 学 时：4 一、实验目的1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。 2.学习鉴别死活细胞的实验方法。二、实验原理 酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

42、用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。三、试剂与器材 1.材料 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。2.试剂 0.05和O.1吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。3.器材 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。四、实验内容1.

43、美蓝浸片观察 酵母培养制片染色镜检30分钟后再镜检2.水-碘浸片观察五、关键步骤及注意事项1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。 2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。六、思考题1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响?试分析其原因。 2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌?实验题目：微生物直接计数法及测微技术 实验类型：基础 学 时：4 一、实验目的1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。 2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。二、实验原

44、理 显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2344)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为01mm，所以计数室的容积为01mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再

45、乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为：lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个)微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长001mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测

46、微尺每格的相对长度。三、试剂与器材1.材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。2.实验器材细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。四、实验内容1.微生物直接计数法 菌悬液制备镜检计数室加样品显微镜计数清洗血细胞计数板 2.微生物测微技术 装目镜测微尺校正菌体大小测定五、关键步骤及注意事项1.防止加样空气泡产生。2.调节显微镜光线的强弱适当。六、思考题 1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确? 2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计12种

47、可行的检测方法。 3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?实验题目：大肠杆菌生长曲线的测定 实验类型：基础 学 时：8 一、实验目的1.了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线。2.复习光电比浊法测量细菌数量的方法。二、实验原理 将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。三、试剂与器材

48、1.材料与试剂 大肠杆菌、LB液体培养基70ml、分装2支大试管(5ml支)、剩余60ml装入250ml的三角瓶。2.器材 722型分光光度计、恒温振荡摇床、无菌试管、无菌吸管等。四、实验内容编号接种培养比浊测定五、关键步骤及注意事项1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定。 2.严格控制培养时间。六、思考题1.根据实验数据画出生长曲线，并说明大肠杆菌生长特征。 2.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点3.次生礼谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?实验题目：水中细菌总数的测定 实验类型：基础 学 时：6 一、

49、实验目的1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2.了解水源水的平板菌落计数的原理。二、实验原理本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、试剂与器材1.试剂 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水2.器材 灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、实验内容1.水样的采取2.细菌总数测定3.菌落计数方法五、关键步骤及注意事项

50、注意全过程防止染菌六、思考题从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？实验题目：细菌细胞的生化反应实验 实验类型：综合 学 时：6 一、实验目的了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法。二、实验原理 各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。 糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形