应用技术蛋白质化学材料

1、无细胞蛋白表达系统的应用无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统， 是模拟生物细胞的生命现象，重 现胞内蛋白转录翻译过程。无细胞蛋白质合成体系以外源目的 mRNA或DNA为蛋 白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、 翻译相关蛋白 因子等物质，能实现目的蛋白质的体外蛋白合成。抗体在治疗、诊断和应用研究领域都起着重要作用，抗体也是检测生物靶标 的重要物质。在临床试验中使用的药物制剂中约有 30%为基因工程抗体。抗体在 诊断和治疗中的重要作用促进了生产高特异性抗体的方法和技术的巨大开展。利用杂交瘤技术生产抗体以及利用原核细胞和哺乳动物细胞生产抗体或抗体片段 技术已经开展的相当完善。然

2、而，基于细胞的蛋白生产比拟耗时，花费也高，高 效的无细胞蛋白合成体系应运而生。在过去的十年里，无细胞蛋白表达系统已成 功生产了不同来源各种特性的多类蛋白， 被证明是可靠、灵活和高效的蛋白生产 平台。无细胞蛋白表达体系已经成功的生产出完整抗体和抗体片段。无细胞蛋白表达系统合成二硫键蛋白：抗体是较为复杂的蛋白分子，包含两 条同样的重链和轻链。每条抗体链都包含清晰的功能域，其中B-折叠以二硫键相连，形成B桶状。二硫键对抗体的折叠和功能起着重要作用。因此，无细胞 蛋白表达体系需要提供能够形成二硫键的环境以表达功能抗体。在过去的十年里，无细胞蛋白体系已经成功表达了二硫键蛋白。最初无细胞蛋白体系表达二硫键

3、蛋白时遇到的两个障碍是，第一，复原剂如DTT通常参加体系中以保持细胞裂解液在储存和翻译过程中的活性；第二，缺乏活细胞内那样具有氧化复原条件的区室如原核细胞中的细胞周质，真核细胞中的内质网以供 二硫键形成。根据细胞裂解液的来源，采取了不同策略。例如，大肠杆菌裂解液 中添参加复原性和氧化型谷胱甘肽的混合物以建立适宜的高氧化复原电位。其他翻译系统主要采用烷基化试剂如碘乙酰胺对裂解液进行预培养以灭活内源性还 原酶。由于碘乙酰胺的使用可能会导致翻译活性的下降，因而开展了其它预处理方法如使用过量的氧化型谷胱甘肽。进一步研究发现，参加外源性的酶，如真核 蛋白二硫键异构酶PDI，能够显著提高无细胞蛋白体系合成

4、 scFv片段的功能。 参加分子伴侣如DnaK DnaJ, GroEL和GroES同样也是有益的，因为这些分子伴 侣提高了无细胞蛋白表达系统合成的 scFv和Fab的可溶性。最成功的表达二硫键蛋白的大肠杆菌无细胞蛋白表达系统米取了多种策略 共同使用的方法。女口，细胞裂解液由突变的大肠杆菌菌株制备，此菌株缺乏一种主要的内源性复原酶 gor strain, KGK10 ;细胞裂解液以碘乙酰胺和氧 化及复原性谷胱甘肽预处理，建立氧化复原电位以适于二硫键形成。 并且，无细胞蛋白表达系统参加外源蛋白如二硫键异构酶C DsbC和PDI，促使二硫键的形成和异构化。真核系统成功表达二硫键蛋白如tPA 1992

5、年使用的是兔网织红细胞体系， 参加狗胰腺微粒体囊泡和氧化型谷胱甘肽。随后，利用复原和氧化型谷胱甘肽和 PDI，二硫键蛋白大肠杆菌碱性磷酸酶两个二硫键和人溶解酵素四个二硫 键在昆虫系统也表达出来，并具有很好的功能。然而，机体内蛋白的合成和折叠是在细胞的不同区域进行的，这就是所说的区室化现象，而前文中提到的各种策略就是试图在同一区室内无细胞蛋白表达系统完成蛋白的合成和折叠。相反的是，在昆虫无细胞蛋白表达系统中，以草 地贪夜蛾Sf21细胞裂解液为根底，目标蛋白合成后，能够进入另一个内源性 区室中完成蛋白的折叠和翻译后修饰如以下图所示。这是由于昆虫的细胞裂解 液包含有起源于内质网的内源性微粒体囊泡。

6、这些囊泡在细胞裂解液制备过程中 形成，内质网破裂，重新组合形成多个较小的区室，成为微粒体囊泡。如果目标 蛋白与适宜的信号肽融合，靶蛋白就可以进入这些囊泡的内腔。 因此，利用昆虫 细胞的无细胞蛋白表达系统，膜蛋白可以合成并包埋入微粒体膜中。 这方面的研 究已有很多报道。原核无细胞蛋白表达系统表达抗体：无细胞蛋白表达系统表达重组抗体乃至 全长抗体的研究中，原核细胞是主要来源。1997年，Ryabova和合作者一起发表 了第一篇利用大肠杆菌无细胞蛋白表达体系合成scFv的详尽的报告，他们分析了不同添加剂对scFv的合成及其功能表现的效果。在这篇报道里，PDI的参加将有功能的scFv的产量提高了三倍，

7、而且，分子伴侣 DnaK和 DnaJ有效提高了 可溶蛋白的量，但是并没有提高功能蛋白的量。 最后一点，各类添加剂的组合使 用复原和氧化型谷胱甘肽，PDI和分子伴侣效果最好。随后，其他一些研究 小组陆续报道了大肠杆菌无细胞蛋白表达体系合成scFv的成功案例。Jia ng及其合作者于2002年报道了首例转录翻译偶联的大肠杆菌无细胞系 统表达Fab的案例，并发现产量低的原因是内源性丝氨酸蛋白酶对靶蛋白的降解 导致，他们随后采用缺乏丝氨酸蛋白酶的大肠杆菌突变体BW25113S行无细胞蛋白表达，解决了这一问题。2022年全长IgG 鼠单克隆抗体MAK33在大肠杆菌 无细胞蛋白表达体系中的合成是一个里程碑

8、意义的进展。随后Yin等2022合成IgG1曲妥单抗以每升反响体系获得几百毫克的产量将前者超越。很显然，无 细胞蛋白表达体系可以将反响体系由毫升扩大到升，因此，Fab和全长抗体能够在标准的生物反响器大至 5L以高产量scFv 800ug/mL,Fab250ug/mL, IgG 400ug/mL进行合成。2022年，利用大肠杆菌工程菌，使用分子伴侣优化的裂 解液，全长抗体的合成进一步提高到每升反响液获得克级抗体的产量。对于抗体合成，除了二硫键的形成，多个功能域蛋白的正确组装对于无细胞 体系和细胞内的蛋白合成都是一个挑战。由于密码子或者mRN二级结构的因素， 不同的模板以不同的速度进行翻译，因此对

9、抗体重链和轻链比例的经验性优化是 很重要的。真核无细胞蛋白表达系统表达抗体：1993年，兔网织红细胞来源的无细胞 蛋白表达系统用来合成scFv-毒素融合蛋白。除了大肠杆菌提取液，兔网织红细 胞裂解液也是利用核糖体展示生产抗体片段的根本翻译系统。2003年首例scFv抗体片段在麦胚来源的无细胞蛋白表达体系中合成。发现用DTT缺乏的麦胚提取 液参加PDI可获得最优的反响体系，1毫升batch系统中合成13ug scFv。同年 开展了基于昆虫sf21的真核翻译系统。和其它真核系统相比，昆虫系统包含微 粒体囊泡。目标蛋白融合信号肽序列，可转运进微粒体囊泡进行蛋白的折叠，类似于体内环境。2022-202

10、2年间连续报道了两例成功利用昆虫无细胞蛋白表达系 统合成功能scFv抗体片段的案例。和其它成功表达二硫键蛋白的体系相比，昆 虫系统只需要进行适当的优化即可：除去复原性试剂DTT参加谷胱甘肽，融合信号肽诱导靶蛋白转运进微粒体囊泡。和其它体系相比，昆虫系统既不需要裂解 液的预处理，也不需要参加其它外源性酶和分子伴侣。无细胞蛋白表达系统对抗体的修饰：蛋白与功能基团如荧光分子、亲和标签、 药物分子等的连接在生物物理、生物技术和生物医学应用中具有特殊的意义。例 如，抗体-药物复合物有助于靶向癌细胞，降低药物副作用，提高治疗效果。抗 体与细胞因子或免疫刺激多肽连接可被用于疫苗(Kan ter, 2007)

11、。在这项研究 里，利用无细胞蛋白表达体系合成的两个 scFv融合蛋白成功用做抗鼠B细胞淋 巴瘤的疫苗。无细胞蛋白表达系统在生产个性化疫苗方面表现出了巨大潜力。将来,我们可能能够利用PCR直接扩增病人自己的免疫球蛋白可变区段，生产个性化疫苗。无细胞蛋白表达体系还可以为目标蛋白共表达并标记上一个或多个非必 须氨基酸。在这方面，体内不可防止的会有很多限制，特定修饰的氨基酸可能会 表现出毒性或者根本不能进入细胞，体外的开放系统不受氨基酸类似物毒性的限 制。无细胞蛋白表达系统在抗体合成方面的开展很快。从第一个scFv的全面报道到全长IgG分子的合成，间隔不到11年的时间。在这样的开展速度下，相信 对于目

12、前仍然存在的问题，很快就会有解决方案。浅述蛋白质别离纯化的新技术摘要：本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新别离纯化技术， 综和近年来国内外的一些 研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种别离纯化方法的优点，同时指出其 缺乏之处。文章最后展望了蛋白质别离纯化技术的开展趋势。关 键词：别离纯化 蛋白质 进展生物技术的开展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术， 已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物 技术生产目标产物，下游过程是

13、指对含有目标产物的物料进行处理、别离、纯化、加工目标产物。本文主要综和近年来国内外的研究结果， 介绍了蛋白质的最新分 离纯化技术。2. 蛋白质的别离纯化方法：2.1浊点萃取法CPE:概念及原理：浊点萃取法cloud point extraction ，CPE 1是近年来出现的一种新兴的 液一液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性外表活性剂 胶束水溶液的溶解性和浊点现象为根底，改变实验参数引发相别离，将疏水性物质与亲水性物质别离。目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的别离与纯化及环境样品的前处理中。CPE法除了利用增溶作用外，还利用了外表活性剂另一个重要性质一一浊点现

14、象。溶液静置一段时间或离心后会形成两个透明的液相：一为外表活性剂相约 占总体积的5%;另一为水相胶束浓度等于CMC外界条件如温度向相反方 向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白， 与外表活性剂的疏水基团结合，被萃取进外表活性剂相，亲水性物质留在水相， 这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质别离的萃取方法就是浊点 萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相别离现象。温度的改变，引起水化层的破坏，增强了外表活性剂的疏水性。蛋白质别离纯化中的应用：CPE法可用于别离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些别离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱

15、方法联用。另外，CPE法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化 酶浊点萃取的中试研究。虽然使用离心别离器可以使 CPE大规模连续进行，但商 品离心别离器用于CPE的效率和容量仍需进一步研究。而且，他们发现相别离 操作受细胞培养时产生的外表活性物质影响较大，体系两相间密度差较小，外表 张力较小，含产物的外表活性剂相的流变学行为较复杂，操作较难。表1列出了CPE法近几年来在蛋白质别离纯化中的应用。(1) CPE法用于别离纯化膜蛋白膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既 要削弱它与膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状

16、态， 较难别离 纯化。由于外表活性刑具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。增溶时， 膜蛋白琉水局部嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白外表的废水结构。相别离后，膜蛋白与外表活性剂共同析出，与亲水性蛋白质别离。所以，CPE 法在别离纯化膜蛋白方面极有优势。(2) 与其它分析技术的联用CPE可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪 器分析的样品前处理方法，提高检出灵敏度。外表活性别可以防止样品吸附在玻 璃容器上，易于与FIA中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合，可 以直接进样。但是在很多应用中需要除去外表活性剂后再与仪器联用。将萃取物

17、与外表活性剂别离的方法很多。 对于CMC> 1mM的外表活性剂如两性离子外表活 性剂可用透析法，但操作时间较长(24h左右)。对于CMC较小的外表活性剂可通 过色谱柱别离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，别离出的外表活性剂可以再利用， 也可以作燃烧处理。但CPEf乍为HPLC的样品前处理方法有两个缺点：第一，常 用的外表活性剂在UV区域有很强的背景吸收。第二，操作时间较长，从色谱柱 上需用几个小时洗脱外表活性剂。外表活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定(3) 。2.2置换色谱法：概念及别离机理：置换色谱(displacement chromatography) 6作为一种非线性色谱技术，是指 样

18、品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相外表的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进， 使样品中各组分按作用力强弱的次序， 形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂 的推动下流出色谱柱7。置换色谱的别离行为与样品组分和置换剂在实验条件 下的吸附等湿线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir型，而且置换剂相对于被别离的各组分应有最强的吸附能力，其吸 附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方7，见图1(A)。根据物料平衡方程， 置换剂在柱中的移动速度uD有以下关系： 式中uD为流动相的线速，巾为相比，qD和

19、cD分别为置换剂在固定相和流动 相中的浓度，qD/cD是直线0D的斜率，称之为操作线(operating line)。当操 作线的斜率小于被别离组分等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图1(中的置换序列，这是在理想的情况下(假定无轴向扩散及二次化学平衡) 获得的置换色谱图。每一组分形成矩形的平台(Plateau)洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台状的色谱图。此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即到达等速状态(isobathic con diti ons)uD= u2; u3 = u4式中u2、u3、u4指被置换的三组分的速度蛋白质特性与别离纯化技术的选择摘要：蛋白质

20、的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物 理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具 有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯 的方法。关键词：蛋白质 别离纯化.、八、-刖言蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的别离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到 目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物 中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的别离提纯程序来获取高纯 度的制品。蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯

21、度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂 蛋白中别离出来，同时仍保存有这种多肽的生物学活性和化学完整性。能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于 蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的 二级结构a螺旋、B折叠和各种转角、三级结构和四级结构，形成独特的大小、 形状和残基在蛋白质外表的分布状况， 利用待别离的蛋白质与其它蛋白质

22、之间在性质 的差异，即能设计出一组合理的分级别离步骤。可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物别离：1 分子大小不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差异，可用一些简便的方法，使 蛋白质混合物得到初步别离。1. 1透析和超滤透析在纯化中极为常用，可除去盐类脱盐及置换缓冲液、有机溶剂、低 分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为 5000左右，如分子量小于10000的酶液 就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。 超滤一般用于浓缩和脱色1. 2离心别离置换缓冲液许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集 1020倍，再对特定的酶

23、进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。 速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最正确别离时间，可 得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，防止了差速离心中大小组分一起沉淀的问 题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗 糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等1. 3凝胶过滤这是根据分子大小别离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及 利用分子量的差异除去热源。2形状蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中 的小孔运动时，都会受到形状的

24、影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具 有较小的有效半径斯托克半径，通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显 得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质 更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白 质要小。3 溶解度禾U用蛋白质的溶解度的差异来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解 度的外界因素很多，其中主要有：溶液的 pH离子强度、介电常数和温度，但在同一 的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白 质混合物中某一成分的溶解度3. 1p H控制和等电点沉淀蛋白质在其等电点一般较不易溶解

25、。3. 2蛋白质的盐溶和盐析3. 3有机溶剂分级法蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从根本不溶v10卩g/ml 直至极易溶解 300mg/ml不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机 溶剂的浓度可别离蛋白质。水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。3. 4温度不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比拟稳定，故别离操作一般在 0 C或更低温度下进行。4. 电荷蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷那么称为酸性蛋白质，4. 1电泳不仅

26、是别离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。2D-PAG吩离蛋白质分辨率已经开展到100000个蛋白点。4. 2离子交换层析改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和阴、阳离子交换填料，不 同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同， 蛋白质因吸附容量不同或不被吸附 而别离。洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别 是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积与柱床体体积相比

27、、盐浓度和 pH,样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。蛋白分子暴露在外外表的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同5. 电荷分布电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的外表，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条 件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦 可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只 能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。6. 疏水性多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白

28、质的内部，但也有一些在外表。蛋白质外表 的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合 从而利用它来进行别离的能力。因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的别离和纯化蛋白 质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保存，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被 洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀别离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目 标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治 疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在别离的同时也进行了复性。7. 密度多数蛋白质的密度在1.31.4g/cm3之间，分级别离蛋白质时一般不常用此 性质，不过

29、对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用 密度梯度法离心与大局部蛋白质别离。8. 基因工程构建的纯化标记通过改变cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端参加少许几个额外氨基酸，这个参加的标记可用来作为一个有效的纯化依据。8. 1GST融合载体使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathi one Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子 Xa切开。8. 2蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 纯化。8. 3 含组氨酸标记(Histidine-tagged) Chelating

30、Sepharose最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上 610个组氨酸，在一般或变 性条件(如8M尿素)下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将 pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合 Ni2+使之得以纯化。重组蛋白在设计、构建时已融入纯化设想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAMLIN适合做粗别离。9 亲和能力结合效率高，别离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特 异性的抗体、吸附后可改变缓冲液的离子强度和 PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更 高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊

31、的生物大分子亲和能力不同来进行相 互别离的，依亲和选择性的上下分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对一类基团 的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能 力；高选择性(专一性)亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。如单 克隆抗体对抗原的特异性的吸附。亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的 作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可防止的脱落进入别离体系。与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高别离效率和大 规模工业化的优点，适用于初别离。按配基的不同可分为：(1) 金属螯合介质过渡金属离子Cu2+、Zn2

32、+和Ni 2 +等以亚胺络合物的形式键合到因定相 上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了 亚胺金属一蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相 吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的 pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互别离。(2) 小配体亲和介质配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。(3) 抗体亲和介质即免疫亲和层析，配体有重组蛋白 A和重组蛋白G,但蛋白A比蛋白G专一， 蛋白G能结合更多不同源的IgG。(4) 颜料亲和介质染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力

33、大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待别离的样品的纯度有关。配体有 Cibacron Blue和 Procion Red两种。在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了 防止此现象的发生，最好要离子强度小于 0。1和PH大于7时操作。(5) 外源凝集素亲和介质配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能 和数种糖类残基发生可逆反响，适合纯化多糖、糖蛋白。10非极性基团之间作用力溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力非选择性分散力或伦敦力大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力 的差异进行别离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂如甲醇、乙腈、 四氢呋喃等，这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须 有离子对试剂如三氟乙酸、甲酸、磷酸等存在才可使别离有效地进行和获得高的 质量回收率；别离须在酸性介质中进行一般 pH在23之间，又有一些蛋白质会 在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子中人别离纯化中受到限 制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。正相色谱在生物大分子中的别离和纯化中应用相对较少，因所用的溶剂很 贵。11 可逆性缔合在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件 下那么形成单