核酸的提取、纯化和电泳检测实验报告

1、分子生物学实验 山东大学 生命科学学院核酸的提取、纯化和电泳检测摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法等等，其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，本实验采用碱变性法提取E.coli DH5中Puc19质粒DNA，并通过RNase消化及酚-氯仿抽提除去质粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可

2、溶性蛋白，最后获得纯度较高的质粒DNA。细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区，本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法，掌握DNA的纯化方法，即用RNase消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质，学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化及纯度检测的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及相应的方法操作。关键词 质粒DNA 碱变性提取法 琼脂糖凝胶电泳 细菌染色体DNA引言1. 核酸分离纯化1.1总原则保证核酸一级结构的完整性化学损伤缩短化学试剂作用时间，以减少其对核酸的损失； 物理损伤动作轻柔以减少机

3、械剪切力；尽量低温操作以减少高温损伤； 生物降解加入相应酶抑制剂，防止生物降解排除其他分子的污染 蛋白质苯酚/氯仿/蛋白酶K RNA污染RNase 其他DNA区别变性与复性 有机溶剂萃取、乙醇沉淀与洗涤 金属离子乙醇沉淀与洗涤1.2核酸纯化应达到的要求 核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 其他生物大分子的污染应降到最低程度 排除其他核酸分子的污染1.3核酸提取的一般过程 破碎细胞（防止核酸酶的作用） 破碎抽提核酸(裂解细胞释放内容物)关键步骤 核酸的纯化除去杂质（蛋白质、脂类、核酸）4°C最佳和最简单；-70°C是长期保存的良好温度，为一次性保存；

4、-20°C 核酸样品的保存（主要条件时温度和介质）-TE缓冲液最常用2. 质粒DNA的提取及纯化碱变性提取法（碱裂解/变性法）RNase消化及酚-氯仿抽提2.1 质粒DNA的制备方法 质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯

5、度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒

6、DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。 提取原则：尽量保持核酸的完整性，即保持天然状态，防止核酸酶对核酸的降解（生物损伤），也要防止化学因素（酸、碱等）或物理因素（高温、机械剪切等）引起核酸变性或破坏。最大限度减少染色体DNA的污染，去除RNA、可溶性蛋白质杂质。2.2 碱裂解法 碱裂解/碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA（线性DNA）与质粒DNA（超螺旋DNA）的变性与复性的条件差异而达到分离目的。质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变

7、性，去除变性条件又可以使DNA复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc(或N

8、aAc)高盐缓冲液调节其pH值至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，变性的质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超螺旋构型，而溶解于溶液中；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，染色体DNA不能复性而与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的网状结构呈白色絮状沉淀，这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RN

9、ase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA，之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。 坚韧细胞壁、细胞膜染色体DNARNA、可溶性蛋白质溶菌酶、SDS变性复性条件不同蛋白酶、RNase、有机溶剂总结：碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 3. 细菌染色体DNA的提取3.1细菌基因组DNA特点细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为

10、致密的区域，称为类核（nucleoid）。类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。具有操纵子结构（有关操纵子结构详见基因表达的调控一章）其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起

11、，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。3.2细菌染色体DNA提取的原理 基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。细菌基因组是环状DNA，在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA。因此要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子

12、热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子，起到抑制核酸酶活性的作用。 与质粒DNA相比选择琼脂糖凝胶浓度应低。4.琼脂糖凝胶电泳进行DNA的分离纯化4.1电泳电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，

13、移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小

14、和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。琼脂糖加热至90左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝

15、胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。4.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，以琼脂糖凝胶为支持物，利用DNA 泳动时的电荷效应和分子筛效应，使不同大小的DNA分子根据分子量而分离，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。4.21琼脂糖每一个琼脂糖链含有大约8

16、00个分子，琼脂糖聚合链形成螺旋状纤维聚集成直径20-30nm的超螺旋结构。纤维是半刚性的，琼脂糖浓度不同，形成的纤维长度不同。固化的时候，螺旋纤维形成三维的筛网，琼脂糖浓度不同，形成的通道直径50nm到>200nm，三维结构依赖于氢键维持，加热成液体状态就破坏了氢键。【琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。】4.22电泳迁移速率的影响因素 糖凝胶电泳是一种常用的方法，溶液中，核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前

17、迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA(open circle DNA, ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA (Liner DNA）分子。这三种构型的分子（图1-3-1）有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA )迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（

18、ocDNA）分子。图1不同构象DNA表1 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。（分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度见图3）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5v/cm。

19、电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10×电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。注意：1、维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-à2H2O+O2)，负极发生还原反应（4H+4e-à 2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，

20、负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变。2、使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。3、电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂

21、糖含量少于0.5时凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。4.23 EB染色DNA的呈现：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA可使用荧光染料溴化乙锭显现并检测。图2 溴化乙锭（见图2）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间（见图3），并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。 将已知浓度的标准样品（如/Hind）作为对照，电泳并经EB染色后，就可以根据DNA条带的宽度与亮度估计出待测样品的浓度。 脂糖凝胶电泳时，使用EB对DNA染色的方法有两种：在制胶中与电泳缓冲液

22、中同时加入0.5 g/mL的溴化乙锭。图3在电泳结束以后，取出琼脂糖凝胶，放在含有0.5 g/mL的溴化乙锭的水溶液中染色10 min。此染色法能准确测定DNA的大小与浓度。4.24琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度 电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需要510 ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测0.050.1g的DNA。由于电泳时所用样品非常少，而且操作简便，所以在基因工程中经常被用作检测DNA样品。但是琼脂糖凝胶电泳法进行定量是基于目测，所以是估计水平，不如用紫外分光光度计法精确。4.25琼脂糖凝胶电泳鉴定核酸纯度：在琼脂糖凝胶电泳上可以观察到染色体DNA、质粒DN

23、A和RNA的电泳区带，跑在溴酚蓝前面的就是RNA。由此可分析样品的纯度。4.26琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA分子量：在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因此，该法还可用于分子量的测定。将未知分子量的DNA样品与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以获得该样品的分子量大小。下图是常用的DNA分子量标准物的迁移图谱和片段大小。正文1.材料和方法1.1材料1.11、实验材料pUC19质粒DNA样品-菌株【E. coli DH5 (pUC19)】碱裂解法提取DNA标准分子量-超螺旋质粒DNA Marker；商品（纯化的）pUC19质粒DNA (20ng

24、/µl)；纯化的 DNA (10ng/µl)； pUC19 /HindIII。细菌染色体DNA-黄色黏球菌 DK1622（特性：基因组全长913Mb，代时：4小时，胞外基质富含粘多糖）1.12、溶液和试剂质粒DNA的提取碱变性提取法溶液I：50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl (pH 8.0）， 10mM EDTA (pH 8.0），高压灭菌15min，储存于4°C)溶液II（0.2N NaOH， 1% SDS，用2M NaOH及10%SDS现用现配）溶液III（5M醋酸钾 KAc-HAc，pH 4.8，贮存于4°C）TE溶液（10mM Tris

25、-HCl(pH 8.0) ，1mM EDTA (pH 8.0) ）RNase母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris.Cl（pH=7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100°C加热15min，使混有的DNA酶失活，冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20°C。氨苄青霉素（Amp）储存液：100µg/ml水溶液，过滤除菌，-20°C保存。预冷无水乙醇，70%乙醇质粒DNA的纯化RNase消化及酚-氯仿抽提Tris饱和苯酚溶液苯酚：氯仿：异戊醇溶液（25：24:1）氯仿：异戊醇溶液NaAc溶液(pH=

26、5.2)70%乙醇，无水乙醇 DNA的检测琼脂糖凝胶电泳分离DNA琼脂糖（agarose）。50 × TAE: 242 g Tris base、57.1 mL冰乙酸、100 mL 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)，去离子水定容至1L。à使用浓度： 1 × TAE 溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）：储存液浓度10mg/mL，工作浓度0.5 µg/mL水溶液。6/10 ×上样缓冲液：30/50%甘油、0.25% 溴酚兰（bromophenol blue，BPB）、0.25% 二甲苯青FF。其它：LB琼脂平板，LB液体培

27、养基，冰乙醇，70%乙醇细菌染色体DNA的提取试剂盒：Bacteria DNA isolation kit （Omega）1.13、仪器恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，离心管，不同型号的吸头，微量移液器等，培养皿，三角瓶，烧杯，天平，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。1.2实验方法1.21质粒DNA的提取、纯化和电泳质粒DNA的提取碱变性提取法I细菌培养在含有氨苄青霉素（100µg/ml）的LB琼脂平板上挑取携带有质粒pUC19的E.coli 单菌落，接种（液壁交界面）于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 200rmp

28、振荡培养过夜。将过夜培养菌液以1%接种量接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中（Amp终浓度 (100µg/ml)），37，200rpm培养46h，即到达菌体生长的对数晚期。II准备工作用桌上的烧杯或搪瓷杯取一杯冰；将小烧杯放在天平上，调至平衡；每组取出一支灭菌的100ml离心管，标记上“组号-1”，称量并记录其重量w1IIIEcoil菌株收获（：4°C操作） 取已称量过且重量标记为W1的灭菌离心管，。 倒入菌液至距瓶口1/3处，两两配平； 6000rpm，离心5min，弃上清（二楼楼梯口右侧）； 加入5ml 溶液，涡旋， 6000rpm，5min，弃上清；将离心管倒置，使上清

29、液全部流尽，用吸水纸擦干，称重，记为w2，并计算w2-w1。IV细胞裂解提取质粒DNA （ 4°C操作）每100mg菌体量，加入 （按菌体量接近的重新分组，溶液I补平） 1.0 mL 溶液，充分涡旋振荡，使细菌完全分散；用溶液I再次配平； 2.0 mL 溶液，轻柔颠倒混匀，冰浴3-5min； 1.5 mL 溶液，轻柔颠倒混匀，冰浴5min； 12000rpm, 15min；小心转移上清到新的离心管内，记录体积V。加入2V冰乙醇，颠倒混匀；-20，15min； 12000rpm，15min，弃上清；加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸弃上清。重复乙醇洗涤一次；37风干5

30、-10min。分次加入1mL TE溶液并转移到Ep管中，得质粒DNA粗提物；质粒DNA的纯化RNase消化及酚-氯仿抽提IRNase消化除去RNA向质粒DNA粗提取物中加入5l RNase A（10mg/ml)，终浓度为50g/mL，37孵育1-2小时II 酚-氯仿抽提1mL粗提取物均分于两个Ep管中。分别加入等体积的Tris饱和苯酚溶液，涡旋，12000rpm，离心5min。转移上清（V1）至新管，加入等体积V1 苯酚：氯仿：异戊醇溶液，涡旋，12000r/min离心5min 转移上清（V2）液至新管， 加入等体积V2氯仿：异戊醇溶液，涡旋，12000r/min离心5min。转移上清至新管（

31、V3），加入1/10 V3体积的3M NaAc溶液(pH=5.2)，再加入2 V4(V4 =1/10V3 +V3)冰乙醇，混合均匀，于-20保存30min。12000r/min离心15min，弃上清。加入70%乙醇500L洗涤，12000r/min离心2min，弃上清。重复洗涤一次，吸弃上清，37风干5min。每管加入25uLTE溶解沉淀，合并，得到50uL纯化质粒DNA。质粒DNA纯度检测琼脂糖凝胶电泳分离DNA用50× TAE配制2L1×TAE；正确组装制胶槽+制胶板+样品梳；取40mL1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称0.4g琼脂糖，倒入三角瓶混匀，轻旋

32、瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至澄清无颗粒；冷至60左右，加入 20µl 1mg/ml的溴化乙锭（EB）溶液，使终浓度为0.5mg/ml，混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用；取2.0l 纯化DNA+2 l ddH2O+1.0l 上样缓冲液（6×loading buffer），吹吸混匀；将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm。将上述混合好的DNA样品，按照下表顺序，点样到凝胶中。泳道12345678样品超螺旋markerpUC19pUC19/HindIII12345样量6(µl)5.0(µl)5.0(µl)5.

33、0(µl)同前5.0(µl)泳道91011121314151617样品超螺旋marker6（+）6（-）78910pUC19/HindIIIpUC19样量6.0(µl)同前5.0(µl)5.0 (µl)5.0(µl)电泳仪使用操作：1.首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。（100-120V）3.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压（一般是5V/cm），设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行，DNA样

34、品从负极向正极移动，待观察到负极有气泡升起方可离开。4. 当前沿DNA接近胶的前端时，切断电源，停止电泳（大约1h，100V），工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头，（未向凝胶中加入EB时，应取出凝胶用于染色）用凝胶成像仪观察，记录结果。1.22.染色体DNA的提取、纯化和电泳I细菌培养将黄色黏球菌菌液32 200rmp振荡培养过夜。将过夜培养菌液以1%接种量接种到液体培养基中，32，200rpm震荡20h，即可收集菌体提取DNA。II菌体收集 将培养液倒入1.5mlEp管中，10.000rpm，2min，弃上清； 重复收集一次，3.0ml/组 菌体沉淀中加入500&

35、#181;lTE，充分涡旋重悬；（同时收集两管，TE重悬后合并） 10，000rpm，离心2min，尽可能吸弃上清III 细胞裂解 菌体沉淀中加入200µl BTL buffer，涡旋重悬； 加入25µl proteinase K溶液，涡旋混匀 55°C水浴45min；期间每15-20min 震荡混匀一次IV DNA纯化 加入25µl RNase A，颠倒混匀； 37°C水浴 30min； 12,000rpm，5min 沉淀不溶性细胞碎片； 小心转移上清到一新的Ep管中； 加入220µlBDL buffer，颠倒混匀； 65°

36、;C水浴10min，促进DNA溶解； 加入220µl无水乙醇，充分涡旋，确保没有任何沉淀； 将DNA纯化柱（蓝色）组装到2ml收集管上； 将上述样品全部、小心转移到柱子中； 12，000rpm，1min使DNA结合，弃流出液； 将柱子组装到第二个收集管上，加入500µl buffer HB； 12，000rpm，1min，弃流出液；将柱子组装到同一个收集管中，加入700µl wash buffer 12，000rpm，1min，弃流出液； 重复洗涤一次； 使用同一收集管，13000rpm，2min，以去除残留的乙醇； 将柱子组装到新的EP管上，加入50µ

37、l65°C 预热的Elution Buffer，室温静置5min； 12，000rpm，1min，收集DNA； 重复收集一次；IV 0.8%琼脂糖凝胶制备正确组装制胶槽+制胶板+样品梳；取40mL1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称0.3g琼脂糖，倒入三角瓶混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至澄清无颗粒；冷至60左右，加入 20µl 1mg/ml的溴化乙锭（EB）溶液，使终浓度为0.5mg/ml，混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用（不少于30min）；V 电泳上样取1.0l 纯化DNA+4.0 l ddH2O+1.0l 上样缓冲液（6×loadin

38、g buffer），吹吸混匀；将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm。将上述混合好的DNA样品，按照下表顺序，点样到凝胶中。泳道1234567样品DNA/HindIII 12345作用MarkerMarker样量5.0(µl)5.0(µl)6.0(µl)泳道891011121314样品DL5000678910/HindIII作用MarkerMarker样量5.0(µl)6.0(µl)5.0(µl)2.实验结果及分析2.1质粒DNA的提取、纯化和电泳2.11实验现象记录及分析经过细菌培养与菌体收集后

39、共得到0.170g菌体实验步骤碱变性提取法RNase消化及酚-氯仿抽提试剂溶液溶液溶液冰乙醇Tris饱和苯酚溶液苯酚：氯仿：异戊醇溶液氯仿：异戊醇溶液NaAc溶液、冰乙醇现象浑浊粘稠状，较透明白色絮状沉淀沉淀溶液分成两层，下层为黄色，上层为无色，两层交界处有白色沉淀析出溶液分成两层，下层为黄色，上层为无色，两层交界处有少量白色沉淀析出分上下两层，均为无色透明液体，但有较为清晰的分相面有沉淀产生分析涡旋振荡，使细胞完全分散，而溶液为等渗溶液，又使细胞不至于破裂SDS使细胞膜破裂，内容物释放絮状物成分：蛋白质、染色体DNA、部分RNA。线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能复性而与不稳

40、定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的网状结构呈白色絮状沉淀，白色是蛋白质的颜色，DNA为无色。无水乙醇是DNA 的沉淀剂，夺去DNA周围的水分，使DNA失水而易于聚合，形成沉淀酚是强的蛋白变性剂,可以蛋白质变性析出，由于酚的密度大位于下层，呈黄色有机相，溶解有质粒DNA的无色水相位于上层，中间析出的白色沉淀为变性的蛋白质。氯仿可以使蛋白质变性同时可以抽提苯酚，异丙醇消除气泡有助于分相。由于氯仿密度大于水，下层为氯仿，上层为溶有质粒DNA的水溶液NaAc溶液中Na+中和DNA分子表面的负电荷，使其不带电荷而聚集，乙醇与水亲和力强于DNA，夺走DNA结合的水分子使DNA分

41、子聚集生成沉淀2.12实验结果图示染色体DNA片段杂质蛋白质杂质与染色体DNA复合体凝胶成像1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17仪拍照如下bp 1184910085802361225026399730492087图1. 碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳RNA污染（未加入RNase对照）1：超螺旋marker ；2：pUC19（2686bp）；3：pUC19/HindIII；4-8,10-15: 提取质粒（其中11为提纯过程中未加入RNase的对照组）；9：超螺旋marker；16：pUC19/HindIII；17：pUC19本组为

42、6组，所提取的质粒DNA电泳结果对应10泳道2.13电泳结果及分析电泳结果（分泳道）描述及分析泳道2：超螺旋构型的pUC19，分子量为2868bp，介于超螺旋marker最下方（分子量最小）两条带之间，由于点样量为100ng，因而亮度为超螺旋marker电泳条带中除5026分子量片段（150ng）外其他片段（50ng）亮度的2倍。泳道3：pUC19/HindIII，被HindIII切过的pUC19质粒应绝大多数因DNA双链被切开而成为线性构型。质粒的不同构型虽然分子量相同，但是构型不同会导致电泳迁移速率的差异，运动最快的是未被切开的超螺旋构型，迁移量最大，条带位于最下方，其次是线型，最慢的是开

43、环状分子，位于最上方，图中可见的只有最下方的超螺旋构型条带和位于最上方的开环状分子条带，且超螺旋构型条带亮度更大，说明比例更高，而本应占绝大比例的线状构型则几乎没有，说明此次酶切效率较低，甚至可能此次实验所用的HindIII已不具有活性。泳道10：为本组提取pUC19质粒电泳结果，自下而上分别为蛋白质-DNA复合物，染色体DNA杂带，超螺旋质粒DNA带与泳道2超螺旋构型的pUC19电泳结果相对比，提取的质粒DNA与商品的pUC19质粒DNA不在同一条带上，而在商品pUC19质粒DNA条带的下面，可见出现了最下方电泳迁移速率快于超螺旋构型的pUC19的物质，不符合预期的结果，由于本实验中质粒片段

44、化的可能性极低，而且此现象出现在所有的组中，因而排除个人操作问题，可能的解释是质粒pUC19由于某种原因构型发生变化，螺旋程度更高，因而电泳迁移速率更快，迁移量更大。pUC19质粒构型改变的原因可能是提取pUC19质粒的E.coli DH5菌种存在变异，培养过程中丢失了部分序列，或者是试剂的原因,使质粒DNA链螺旋化程度增加。具体原因需要进一步酶切鉴定。本次实验中只有10组有成带系的超螺旋构型的pUC19，本组即6组因为量较少，超螺旋构型pUC19虽然可辨但是不成带系。远离下方超螺旋构型pUC19条带（位于中间偏上）的白色亮区是由于加入溶液II或溶液III后过度震荡使大肠杆菌基因组DNA断裂形

45、成的可溶于水的较小片段。由于分子量较大进入胶后无法继续运动。留滞于孔内和孔的附近的白色区域是提取质粒DNA过程中未除干净的蛋白质，其与DNA缠绕因而也显色。本实验中未能将蛋白质除净的原因可能是在酚-氯仿抽提时未能充分涡旋使酚和氯仿充分与蛋白质接触，因而残留一部分未变性而滞留于水溶液中的蛋白质，或者在吸取上清液时吸入少量已经变性沉淀的蛋白质，在电泳时，与大分子染色体DNA碎片结合，由于蛋白质带相反电荷，有向相反方向运动的趋势，因而无法进胶电泳而留滞于孔中。开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，因此样品中含有少量线形和环状DNA.泳道11：未加入RNase除RNA杂质的pUC19质粒电泳

46、结果，最下方高亮白色区域为RNA，由于RNA分子量较小，性质与质粒DNA相似，若不用RNase降解则无法与质粒RNA分离，在电泳过程中电泳迁移速率最快，迁移距离最远，位于最下方，RNA片段大小不一，因而呈片状分布而不是清晰的带状。由此可知RNase 降解RNA效率较高，若不用RNase处理则RNA杂质对最终结果影响较大。结论及分析提取质粒的电泳结果并不符合预期，提取的质粒DNA的迁移距离大于相应pUC19质粒的商品标准的迁移距离，原因可能有两个，提取的质粒DNA分子量小于pUC19质粒的商品标准，问题可能出于菌株的变异。提取质粒的带型并不正常，不属于基本带型中超螺旋型、线型和开环型的任何一种，

47、而是在分子量不改变的前提下，螺旋程度高于超螺旋构型，可能的原因一是菌株变异，二是试剂的影响。提取质粒的质量（纯度）：分离纯化的质粒DNA样品中含有残存染色体DNA片段，图中可从（位于中间偏上）白色亮区观察得知，是由于加入溶液II或溶液III后过度震荡（时间较长或动作力度过大）使细菌染色体DNA断裂形成可溶于水的较小片段（但仍大于质粒DNA），为了避免染色体DNA断裂残留杂质，应注意在加入溶液II或溶液III后颠倒混匀时应动作轻柔且要注意控制时间。分离纯化的质粒DNA样品中并不含有残存RNA，可以通过对比泳道11（未加入RNase处理），没有位于下方的小分子条带，说明RNA杂质去除较为彻底。分离

48、纯化的质粒DNA样品中含有蛋白质杂质，可从孔中和孔附近的白色亮区观察得知，原因可能是在酚-氯仿抽提时未能充分涡旋使酚和氯仿充分与蛋白质接触，应注意在用有机试剂抽提蛋白质时充分混匀使反应充分进行，另一方面在进行酚-氯仿抽提时，吸取上清液时可能吸入少量的蛋白质，应注意在取上清液时不可求快，剩余少量时换小量程减小抽力，控制好枪尖的位置，慢速进行操作。提取质粒的相对定量，估计样品的浓度 =75ng / µ l （利用已知质量的商品DNA为依据，如泳道1中的超螺旋质粒DNA Marker或者泳道2的 100ng pUC19 质粒DNA）。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或R

49、NA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。 将已知浓度的标准样品作为对照，电泳并经EB染色后，就可以根据DNA条带的宽度与亮度估计出待测样品的浓度。已知浓度的标准样品：Supercoiled DNA Ladder Marker(浓度 : 500 ng/ 6l )：由 8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA Size大小如表，每次取6 l 电泳时，每条带的DNA量约为50 ng，其中5 kbp条带的DNA量约为其他条带的3倍 (150 ng)，显示亮带。大小（bp）2,087

50、3,0493,9975,0266,1228,02310,08511,849DNA量（ng） 50505015050505050上样量直接上样：6l泳道10为本组提取的质粒DNA，与泳道1的超螺旋Marker相对照，本组提取质粒DNA电泳发光后的亮度与超螺旋Marker中分子量为5,026（150ng）超螺旋条带的亮度相近，估计值为150ng，加样量中纯化DNA的量为2µl，则估计样品的浓度 =总质量估计值/加样量中纯化DNA量=150ng/2µl=75ng / µ l 2.2细菌染色体DNA的提取、纯化和电泳：2.21实验现象记录及分析实验步骤细胞裂解试剂BTL

51、bufferproteinase K现象涡旋后溶液由黄色粘液状变成较清的黄色溶液，产生较多气泡，有沉淀产生。黄色变淡分析BTL buffer中含有SDS产生较多气泡，使细胞膜溶解，溶液变澄清，同时也释放色素，溶液变为黄色。沉淀为不溶性细胞碎片降解蛋白质，使细胞裂解，与SDS一起作用活性较高，色素被降解而黄色变淡2.22实验结果图示蛋白质杂质与染色体DNA复合体1413121110987654321凝胶成像仪拍照如下完整染色体DNAbp 2313094166557436123222027bp 2313094166557436123222027图1. 碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶

52、电泳bp 20001000750500250100图2. 黄色黏球菌提取染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳 1：DNA Marker；2：/HindIII；3-7,9-13: 提取的染色体DNA；8：DL2000 Marker;14：/HindIII Marker本组为6组，所提取的染色体DNA电泳结果对应9泳道泳道1：DNA Marker，DNA是噬菌体中的DNA，呈线状。分子量为，与/HindIII Marker分子量为23130的条带处于同一水平线上，DNA的分子量显然大于其片段，但是由于琼脂糖凝胶浓度选择范围限制，0.8%分离范围仅为0.220kb，大于20kb的DNA片段不可被分离而相互堆

53、叠。泳道2：/HindIIIDNA呈线状且有7个HindIII酶切位点，切割后应形成8个分子量各不相同的DNA片段，但图中之可见6个片段，DNA片段的分子量从上到下（迁移距离增加）亮度依次减弱，分子量最大的亮度最大，缺失了两条分子量最小的条带。分析原因同样分子数条件下，分子量越大结合EB越多，显像越亮，相反分子量越小结合EB少，EB在电场作用下向相反方向运动，分子量小的DNA片段运动快，与EB充分接触机会少，而且由于迁移距离大，最终所到达的位置EB含量较少，因此显色暗，甚至无法从图中辨别。若要使小分子片段DNA显像，需要提高加样量。条带向上弯曲原因：上样量较多；电泳液、胶中离子浓度不同；孔不光

54、滑，可能是拔梳子时有纵向滑动。泳道8/14：DL2000 Marker，最上方为分子量2000的DNA片段，与/HindIII分子量为2027的条带位置相近。泳道9：为本组（6组）提取的细菌染色体DNA，2、4、5组点样孔中有明显的荧光（该荧光应为染色体DNA提取物中残留的蛋白质与DNA交联所致）。说明蛋白质降解不彻底，可能是proteinase K或BDL buffer处理时间较短不充分，或者使用buffer HB、wash buffer清洗杂质不够彻底。在点样孔下放距离很近的胶中可以观察到少量的荧光，据推测这部分应为较完整的染色体DNA。因为真正完整的染色体DNA由于分子量大应与蛋白质缠绕

55、留滞于孔中或者入胶但由于分子量较大（黄色黏球菌基因组全长达913Mb，在0.8%的琼脂糖凝胶中几乎无法迁移）无法继续运动而位于孔的附近，但本组结果中孔及孔附近的亮度较低，说明完整的染色体DNA较少，染色体DNA在提取时有丢失或者破裂程度较高。图中所示的亮条带并非只是一种分子量的DNA片段，由于染色体DNA随机断裂成分子量不一的片段，但是受到0.8%的琼脂糖凝胶分离范围的限制，只可分离0.220kb的DNA片段，大于20kb的DNA片段会超过分辨范围而相互堆积。造成染色体DNA断裂程度较高的原因可能是DNA释放后，操作过程中混匀的动作较为剧烈，应注意一旦染色体已经释放，动作要轻柔谨慎。由于琼脂糖

56、凝胶浓度选择范围限制，0.8%分离范围仅为0.220kb，低于0.6%会使凝胶易脆，又由于细菌染色体分子量较大以Mb计量，即使是染色体DNA的片段也很大，因而不能用常规的琼脂糖凝胶电泳确定提取的染色体DNA片段大小。分子量较小、迁移量较大的DNA片段在图中并未充分显像，但这并不代表染色体DNA断裂没有形成较小分子量的片段，在调整亮度的过程中隐约可见亮带以下部分有弥散分布的灰白色暗区，推测为有随机断裂形成的分子量较小的不均匀DNA片段，分子量较小、迁移量较大的DNA片段在图中并未充分显像是由于在同样分子数条件下，分子量越大结合EB越多，显像越亮，相反分子量越小结合EB少，EB在电场作用下向相反方向运动，分子量小的DNA片段运动快，与EB充分接触机会少，显色暗，甚至无法从图中辨别。若要使分子量较小的片段显像，需要提高加样量。2.3质粒DNA与细菌染色体DNA提取实验的比较2.31实验结果电泳显像后，要的目的条带不同，质粒DNA提取纯化