仪器分析讲义正式

1、9TI0Z实验一荧光分光光度法测定维生素B2一、实验目的1、学习荧光分析法的基本原理2、了解荧光分光光度计的构造，掌握其使用方法。二、实验原理在一定波长紫外光的照射下，维生素B2会发出荧光。在PH67的溶液中荧光最强，在PH11时荧光消失。在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。因此，选择荧光峰值波长为测量波长，测量维生素B2溶液的荧光强度，可对维生素B2进行定量分析。本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。三、仪器与试剂仪器960型荧光分光光度计、比色皿1个、50ml容量瓶6个、5.0ml吸量管1支。试剂维生素B2标准溶液、1%醋酸溶液、维生素B2样品溶液。四、实验内

2、容1、配置标准溶液(实验室准备)(1) 维生素B2标准溶液：取维生素B2约10mg,精密称定，置1000ml容量瓶中，用1%醋酸溶解并稀释至刻度。再精密量取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置50ml容量瓶中，以1%醋酸稀释至刻度，待测。(2) 维生素B2样品溶液：取维生素B2片20片，精密称定，计算平均片重。研细混匀后，精密称取2片量的维生素B2片样品粉未，置1000ml容量瓶中，用1%醋酸溶解并稀释至刻度。滤过。精密取续滤液2ml,置50ml容量瓶中，以1%醋酸稀释至刻度。待测。2、测定(1) 扫描图谱：选择EM=200700nm，lEX=365nm(固定波长)对空白和维

3、生素B2标准溶液进行扫描，找出荧光峰值处对应的lEMmax。(2) 标准工作曲线的绘制(F-C)：在lEMmax下分别测定上述五种维生素B2标准溶液的荧光强度(INT),然后以浓度(ug/100ml)为横坐标，荧光强度(INT)为纵坐标绘制标准工作曲线。(3) 维生素B2样品溶液中维生素B2的含量测定：将配置好的维生素B2样品溶液置1cm比色皿中，以1%醋酸为空白，在上述波长下测定荧光强度值，从工作曲线上求出维生素32样品溶液中维生素B2的浓度。五、数据处理及计算(1)标准工作曲线的绘制编号12345维生素B2标准溶液的浓度(ug/100ml)荧光强度(INT)(2)根据样品液的F值，从工作曲

4、线上求出维生素B2样品溶液中维生素B2的浓度。根据测得结果,求算维生素B2片中维生素B2的含量(mg/片)。六、思考题1、荧光法有何优缺点？它的适用范围是什么？实验二气相色谱法测定混合溶剂的含量归一化法定量一、实验要求1. 掌握气相色谱分析的基本原理和操作。2. 掌握色谱条件优化的原则及方法。3. 学习定量校正因子及归一化法定量分析的基本原理和测定方法。4. 熟悉色谱工作站的操作。二、基本原理气相色谱法是以气体（载气）为流动相的柱色谱分离技术。其原理是利用被分离分析的物质（组分）在色谱柱中的气相（载气）和固定（液）相之间分配系数的差异，在两相作相对运动时，在两相间作反复多次（103106次）的

5、分配，使得原来的微小差别变大，从而使各组分达到分离的目的。根据色谱图进行组分的定量时，所用定量方法主要有归一化法、内标法和外标法三种。把所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方法称为归一化法。归一化法的优点是计算简便，定量结果与进样量无关，且操作条件不需严格控制，是常用的一种色谱定量方法，当各组分色谱峰宽窄比较悬殊情况下，采用此法较为准确。该法的缺点是试样中所有组分都必须分离流出，并且得到可测量的信号，其校正因子也均为已知。为了消除色谱条件对响应值勤的影响，在色谱定量分析中通常采用相对校正因子f.即被测物质i与标准物质S的绝对质量校正因子之比值：fi=fi/fs=（mi/Ai）/（ms/As

6、）=miAs/msAiiisiississi使用归一化法定量，要求试样中的所有组分都能得到完全分离，并且在色谱图上都能出峰，计算式为：m%=fArfAX100iiiii本实验通过测量混合烃试样中各组分的峰面积，利用相对校正因子，用归一化法计算出各组分百分含量。三、仪器和试剂1.仪器：Agient7820A型气相色谱仪；氢焰离子化检测器（FID）；AgientHP-5毛细管色谱柱（30mx0.32mmx0.25pm，非极性柱）；载气为氮气。2试剂和样品：甲苯（沸点110.6C）、氯仿（沸点61.2C）、环己烷（沸点80.7C）、二氯甲烷（沸点39.8C）,均为分析纯。待测样品为含以上4种试剂的含

7、量未知的混合液。四、色谱条件1. 汽化温度：200C；2. 柱温：75C；3. 检测器温度：200C；4. 载气流量：2mL/min5. 进样量：0.1吐；分流比：5:1。五、实验步骤1. 根据色谱条件按操作规程将色谱仪调至可进样状态，待仪器上的电路和气路系统达到平衡，记录仪上基线平直时，即可进样。2. 以甲苯为标准物质测定氯仿、环己烷、二氯甲烷的相对校正因子。配制体积比为1：1：1：1的上述4种试剂的混合标准液，按色谱条件进样。根据每种溶剂对照品的保留时间指认混合标准液图谱上每个色谱峰对应的组分，使用色谱工作站程序测算相应的峰面积，计算各物质的相对校正因子。3. 注入待测样品，测算相应的峰面

8、积，用归一化法计算各物质的质量百分含量。4. 按操作规程进行关机等操作。六、数据处理及结果计算将混合标准液和待测样品中各溶剂的保留时间及峰面积列于下表中，并计算相对校正因子和质量百分含量：组分保留时间（min）峰面积A.i相对校正因子f.样品峰面积A.i百分含量（）甲苯1氯仿环己烷二氯甲烷七、思考题1. 在色谱定量分析中，为什么常常需要测定被测组分的相对校正因子？氢焰离子化检测器有什么特点，其相对校正因子能否用于其它检测器？2. 归一化法定量分析有何特点？使用该法应具备哪些条件？在色谱分析中，还有哪些定量分析方法？试简述其原理。3、本实验中，主要色谱条件（汽化温度、柱温、检测器温度）确定的原则

9、分别是什么？实验三饮料中咖啡因的高效液相色谱法测定外标法定量一、实验要求1. 熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；2掌握外标法定量。二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%1.8%，在茶叶中约为2.0%4.7%。可乐饮料、止痛药片均含咖啡因。咖啡因的分子式为C8H10O2N4,结构式为：81024CH在化学键合相色谱法中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合色谱法。反之，若流动相

10、的极性大于固定相的极性，则称为反相化学健合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱峰18面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线算出其浓度。咖啡因的甲醇液在272nm波长下有最大吸收，其吸收值大小与咖啡因浓度成正比，样品通过高效液相色谱分离，以保留时间定性，峰面积定量。三、仪器与试剂1. 仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪；DAD检测器；超声波清洗器；0.45卩m微孔滤膜。2. 试剂：甲醇为色谱纯；水为高纯水；咖啡因标准品，纯度98%以上。3. 样品：市售的可口可乐、百事可乐、康师傅绿茶等瓶装饮料。四、实验方法1. 样品溶

11、液的制备分别取市售可口可乐、百事可乐、康师傅绿茶饮料适量，超声脱气15min,取脱气试样2ml经稀释定容至10mL,过微孔滤膜后作HPLC分析用。2. 标准曲线系列溶液的配制用甲醇配制咖啡因浓度为1000yg/mL的标准储备液，备用。用流动相（甲醇）将储备液稀释制成浓度分别5、10、20、30、40、50yg/mL的标准系列溶液，过微孔滤膜后作HPLC分析用。3. 高效液相色谱参考条件 色谱柱：Co4.6x150mmx5卩m,或其他型号C18柱；18 柱温：25C； 流动相：甲醇+水（40+60）； 流速：1mL/min； 测定波长：272nm； 进样量：10卩1。4测定将流动相置于超声波清洗

12、器上脱气15min，微孔滤膜过滤。根据实验条件，将仪器按照仪器的实验操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作或记录仪的基线呈直，即可进样。依次分别吸取10卩L的六个标准溶液进样，记录各个色谱数据。依次分别吸取10卩L的市售饮料试样进样，记录各色谱数据。五、数据处理及结果计算1.处理色谱数据，将标准溶液及试样溶液中咖啡因的保留时间及峰面积列于下表中：溶液tR/minA/mVs标准溶液5gg/mL标准溶液10gg/mL标准溶液20gg/mL标准溶液30gg/mL标准溶液40gg/mL标准溶液50gg/mL可口可乐百事可乐康师傅绿茶2. 绘制咖啡因面积质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。3. 根据试样溶液中的咖啡因的峰面积值，计算可口可乐、百事可乐、康师傅绿茶中咖啡因的质量浓度。X=VXP/M式中：X样品中咖啡因的含量，卩g/mL；p被测液在标准曲线上查得的量