流式细胞术——交大版

1、流式细胞术流式细胞术 -原理、操作及应用原理、操作及应用生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室地址：西7楼107室电话：63846590-776423主要内容主要内容 一、流式细胞仪结构和原理一、流式细胞仪结构和原理 流式细胞术简介流式细胞术简介 流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的光信号检测 流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成 荧光抗体的选择荧光抗体的选择 流式细胞术数据的存贮、显示与分析流式细胞术数据的存贮、显示与分析 二、流式细胞术操作与技巧二、流式细胞术操作与技巧 三、流式细胞术在生物医学中的应用三、流式细胞术在生物医学中的应用1.1 流式细胞术简介流式细胞术简介 流式细胞术（流式

2、细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点流式细胞术的特点 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数；检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析；检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞检测速度：高速，最高达上万个细胞/

3、秒；秒； 检测结果：精度高、准确性好；检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；可对目标细胞进行分选；流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类 分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。 分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。式细胞仪一般只用于分选。流式细胞仪的发展及商品化流式细胞仪的发展及商品化 1934 Mol

4、davanl: First try (固定式细胞分析固定式细胞分析-流动式流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统鞘流系统(解决难题解决难题)； 1956 Coulter原理原理(血细胞计数器血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用；分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置；等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等等: 第一台荧光检测细胞计第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪研制出荧光激活

5、细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪式细胞仪-FACS 。 1975 Kohler和和Milstein: 单克隆抗体技术单克隆抗体技术(促进流式发展促进流式发展)。BD公司分析型流式细胞仪公司分析型流式细胞仪FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACS Canto II 双激光六色，三激光八色FACS Verse双激光六色，三激光八色BD公司分选型流式细胞仪公司分选型流式细胞仪FACSVantage SEFACSAria

6、 IIIInflux1.2 流式细胞术光信号检测流式细胞术光信号检测 光信号的类型光信号的类型 散射光信号散射光信号：与标记荧光素无关，与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。是细胞的固有参数。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC); 侧向散射光侧向散射光(side scatter, SSC). 荧光信号荧光信号 自发荧光自发荧光 (细胞色素因子、核黄素细胞色素因子、核黄素)：微弱微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。的荧光，比自发荧光强很多倍。1.2.1 散射光信号散射光信号（一）前向散射光（一）前向散射光F

7、SC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内，度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力体积大小和活力。（二）侧向散射光（二）侧向散射光SSC SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散度散射光，其信号强度反映射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）散射光的作用（三）散射光的作用 实验中，常利用实验中，常利用FSC和和SSC这两种参数的组合，区分不同的这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去

8、除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞粒细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片红细胞、死细胞和碎片死细胞死细胞或碎片或碎片粘连粘连细胞细胞肿瘤细胞株肿瘤细胞株FSC/SSC散点图散点图死细胞死细胞加药处理后加药处理后FSC/SSC散点图散点图 通过通过FSC/SSC散点图，散点图，gate出目标细胞进行分析。出目标细胞进行分析。1.2.2 荧光信号荧光信号（一）荧光：（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。为高能状态，再回到低能状态时释放出的光

9、。发射波长发射波长(荧光波长荧光波长)Emission wavelength激发波长激发波长Excitation wavelength（二）常用荧光素（二）常用荧光素499nm 蓝色荧光（蓝色荧光（Blue）； 500-549nm，绿色荧光（，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（，黄色荧光（Yellow）； 585-615nm，橙色荧光（，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（，红色荧光（Red）； 700nm，远红外荧光（，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素标记抗体的荧光素荧光素分子荧光素分子激发光波长激发光波长（nm）发射光波长发射光波长（n

10、m）中文名中文名FITC490520异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665核酸荧光染料核酸荧光染料PI（碘化丙啶（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于于DNA分析，需要用分析，需要用RNase处理细胞排

11、除处理细胞排除RNA对对DNA荧光定量的影响；荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与以插入的方式与DNA链的链的G-C碱碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与可以非嵌入方式与DNA链上链上的的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染

12、料。定量染料。Hoechst（343, 450）常见为常见为Hoechst33342和和Hoechst33258，非嵌入的，非嵌入的方式与方式与DNA链上的链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA

13、双参数分析。双参数分析。1.3 流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成 液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统 光学系统光学系统 激发光源激发光源 光束收集系统光束收集系统 电子系统电子系统 光电转换器光电转换器 数据处理系统数据处理系统 细胞分选系统细胞分选系统 喷嘴喷嘴 电偏转板电偏转板 样本收集器样本收集器1.3.1 液流系统液流系统 鞘流技术：根据层流原理发鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。

14、流体动力学聚焦：稳定的液流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在径被约束在10-20um，避免，避免了多个细胞重叠进入检测区。了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液鞘液鞘液细胞流细胞流激光照射点激光照射点流体动力学聚焦示意图流体动力学聚焦示意图1.3.2 光学系统光学系统（一）（一）激发光源激发光源 ：激光器：激光器 气体激光器：氩离子气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪离子、氪离子 (647nm)、氪氩、氪氩(568nm)

15、； 染料激光器：如氩离子激光泵浦的染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器，发出光器，发出550-650nm可变波长激发光；可变波长激发光； 半导体激光器半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。价格低、结构简单、寿命长。BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半导体激光器。半导体激光器。 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 现在仪器常配有仪器选配现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为根激光器，波长多为488nm、633nm和和355nm、405nmUV；（二）光收

16、集系统（二）光收集系统 滤光片滤光片的组成的组成 长通滤片长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；：只允许特定波长以上的光束通过； 短通滤片短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；：只允许特定波长以下的光束通过； 带通滤片带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。：只允许一定波长范围内的光束通过。Long pass Short pass Band pass460 500 540460 500 540460 500 540 全反射光路全反射光路FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统流式细胞仪器信号检测系统PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFI

17、TCSSC1.3.3 电子系统电子系统 光电检测器光电检测器将光信号转换成电子信号。将光信号转换成电子信号。 前置放大电路前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。将信号等比例放大，输出电脉冲信号。 模数转换器模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。 数据处理系统数据处理系统计算机系统数据采集、分析。计算机系统数据采集、分析。（一）（一）光电检测器光电检测器(photodetector) 光电二极管光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（光灵敏度低，测定强信号（FSC）；）； 光电倍增管光电倍增管(photomultiplier, P

18、MT)光灵敏度高，测定弱信号（光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光前向散射光光电二极管光电二极管（二）（二）电信号两种放大方式电信号两种放大方式 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用处理，一般信号的放大可以使用线性线性或或对数对数两种方式。两种方式。 线性线性(linear; lin) 对数对数(logarithmic; log) 一般一般FSC和和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用

19、对数放大。变异范围较大，多使用对数放大。（三）（三）荧光信号的面积荧光信号的面积A、宽度、宽度W和高度和高度H 细胞通过激光检测区域时，产生的荧光信号被光电倍增管接收，形成脉冲信号。荧光信号脉冲形成示意图荧光信号脉冲形成示意图TimeVoltsPulse AreaPulse HeightPulse Width0荧光信号脉冲的面积、高度和宽度荧光信号脉冲的面积、高度和宽度Width = Area/Height一个信号脉冲有高度、面积和宽度。 光信号电信号数字信号光信号电信号数字信号 通道通道(channel) 一个光电检测器一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管就是一个通道，有多少个光电

20、二极管/倍倍增管，就有多少个通道：增管，就有多少个通道： 散射光通道散射光通道: FSC通道和通道和SSC通道；通道； 荧光通道荧光通道 通道命名方式：通道命名方式： 以以FL(fluorescence)加数字命名，如加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。等。 以该通道接收的主要荧光素命名，如以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。 For example：FACSCalibur有有488nm和和633nm两根激光器，两根激光器，488nm能检测能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、 FL2(PE)、 FL3(PerCP)，635能检测能

21、检测FL4(APC)，代表，代表Calibur有有6个通道，最多能同时个通道，最多能同时检测检测4个荧光，个荧光，6种参数。种参数。1.3.4 流式分选流式分选 电荷式电荷式分选分选超声振动器超声振动器(15-100kHz)液流充电系统液流充电系统高压偏转板高压偏转板收集装置收集装置(流式管、培养板流式管、培养板)lasers断裂点断裂点(充电充电)高压偏转板高压偏转板四路分选原理四路分选原理电荷式分选装置电荷式分选装置分选指标分选指标 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。需要收集的细胞数。需要细胞数目标细胞所占

22、比例(%)15501041.7 min20 s2 s10516.8 min3.4 min20 s1062.8 h3.4 min3.4 min1071.2 天5.6 h34 min分选时间表分选时间表(机器流速机器流速10000个个/s时时) 分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。 分选纯度分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。以上。 分选收获率分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率分选

23、纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。降低，反之亦然。 富集模式富集模式(enrich mode) 纯化模式纯化模式(purify mode) 单细胞模式单细胞模式(single cell mode)1.4 荧光抗体的选择荧光抗体的选择A 根据流式细胞仪选择抗体根据流式细胞仪选择抗体 流式细胞仪能检测的通道数流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定的光学滤片决定)。如。如FACSCalibur： 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以

24、随意搭配。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP 530/30515-545FITC、AF488FL2BP 585/42564-606PEFL3670 LP670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP 661/16653-669APC、AF647B 根据抗原表达强弱合理选择根据抗原表达强弱合理选择抗体抗体 不同的荧光素强度有所不同；不同的荧光素强度有所不同； 高表达的抗原可用不太高表达的抗原可用不太“亮亮”的染料，更的染料，更“亮亮”的荧光素分的荧光素分配给表达低的抗原：配给表达

25、低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。同时需要正确的调节补偿。CD51.5 FCM数据存储、显示与分析数据存储、显示与分析 标准的标准的FCM数据采用数据采用列表模式（列表模式（list mode），记录了每个，记录了每个细胞的所有参数的信息。细胞的所有参数的信息。 每个细胞检测每个细胞检测5个参数，那么获取个参数，那么获取10000个细胞，容量为个细胞，容量为510000（字或双字）。（字或双字）。Event #FSCSSCFL1 FITCFL2

26、PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015FCM数据显示方式数据显示方式 单参数直方图单参数直方图(Histogram) 双参数数据显示：双参数数据显示： 散点图散点图(Dot Plot) 伪彩图伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图等高线图(Contour Plot) 密度图密度图(Density Plot) 假三维图假三维图(Pseudo 3D Plot) 三维图三维图(3D Plot) 常用分析软件常用分析软件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express

27、直方图直方图Histogram 细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。是细胞数。Event #FL1 FITC110270037204150101001000CountsFITC荧荧光强度光强度 横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。DNA倍体分析倍体分析抗原表达分析抗原表达分析Overlay图图散点图散点图 散点图中每个点代表一个细胞，散点图中每个点代表一个细胞，X轴与轴与Y轴分别代表

28、一种参轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。数，优点是比直方图直观。FL1FL2散点图和伪彩图散点图和伪彩图等高图和密度图等高图和密度图 等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。 密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。细胞少。假三维图和三维图假三维图和三维图SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 设门与数据分析设门与数据分析 门门(Gate，简写，简

29、写G)是流式细胞术中的一个重要术语，是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。据分析过程实际上就是选门和设门的过程。椭圆形椭圆形圆形圆形矩形矩形任意形状任意形状 R(Region，区域，区域)。门可以是单一区域。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几，也可以是几个区域组合在一起：个区域组合在一起：G=R1 and R2; G=R1 or R2; G=R1 not R2。十字门十字门线性门线性门二、流式细胞术操作与技巧二、流式细胞术操作与技巧流式细胞术操作流程流式细胞术操作流程：培养细胞血液骨髓新鲜组织石蜡包埋单细胞悬液制备荧光染色上机检测表型测定细胞分选继

30、续培养FISHPCR统计学分析 2.1 单细胞悬液制备单细胞悬液制备 2.2 免疫荧光标记免疫荧光标记 2.3 对照的设置对照的设置 2.4 光谱重叠与补偿光谱重叠与补偿2.1 单细胞悬液制备单细胞悬液制备 2.1.1 新鲜实体组织的样本制备新鲜实体组织的样本制备 对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产量高产量高、损伤小损伤小的目的。常用方法有：的目的。常用方法有：酶消化法酶消化法机械法机械法化学试剂处理法化学试剂处理法 酶消化法酶消化法：根据

31、分散组织类型来确定使用的酶类：根据分散组织类型来确定使用的酶类：胰蛋白酶胰蛋白酶水解酯键、肽键；水解酯键、肽键；胶原酶胶原酶降解几种分子类型的胶原；降解几种分子类型的胶原；溶菌酶溶菌酶水解糖蛋白、肽的糖苷键；水解糖蛋白、肽的糖苷键；弹性蛋白酶弹性蛋白酶消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。1. 将新鲜组织置于离心管中，加入将新鲜组织置于离心管中，加入1-2ml酶消化酶消化20-30min（恒温（恒温37或室温），间断振荡或吹打；或室温），间断振荡或吹打；2. 终止消化，收集细胞悬液，终止消化，收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，除去目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎

32、片；细胞团块，低速离心除去细胞碎片；3. 将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。 注意注意：酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的pH值。值。机械法特点机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。组织解离器 机械法机械法：有有剪碎法剪碎法、网搓法网搓法、研研磨法磨法等。等。利用机械方法、物理方利用机械方法、物理方法给予组织交大的压力，法给予组织交大的压力

33、，使细胞从组织间分散开使细胞从组织间分散开来。来。 化学处理法化学处理法：作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。等。EDTA是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。酶）。 特点特点：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。和聚集

34、量不稳定。 机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响FCM结果，如低结果，如低速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。 酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。但会造成所测化学成分的不良影响。 根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要求细胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活求细

35、胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活性不受到明显损伤，保证下一步荧光染色。性不受到明显损伤，保证下一步荧光染色。2.1.2 石蜡包埋组织样本制备石蜡包埋组织样本制备切片：将石蜡组织切成50um厚的组织片4-5片，放入1试管中；脱脂：加入二甲苯3-5ml脱脂，室温下1-2天，脱净后弃二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10 min，去乙醇后加入蒸馏水3-5ml，3-5min后弃水；消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶（pH 1.5-2.0），37恒温水浴30 min，每隔5-10min振荡一次；终止消化：加冷的PBS或生理盐水终止消化；过滤：用300

36、目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；收集细胞悬液：将过滤液离心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速离心沉淀去除碎片；根据实验目的标记荧光抗体，或保存细胞备用。2.1.3 血液、骨髓样本制备血液、骨髓样本制备 外周血单个核细胞外周血单个核细胞PBMC的分离的分离血液层Ficoll层血浆层PBMCFicoll层红细胞层离心前离心后Ficoll密度梯度离心法分离密度梯度离心法分离PBMC注意：注意： 由于多核粒细胞比较大，由于多核粒细胞比较大，粒细胞沉降在红细胞层，粒细胞沉降在红细胞层，所以该法不适合粒细胞所以该法不适合粒细胞研究；研究； 该法操作过程中可能丢该法操作过程中可能丢失一些有意义的

37、细胞或失一些有意义的细胞或细胞亚群，所以临床上细胞亚群，所以临床上一般不主张分离血液或一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞。骨髓的单个核细胞。 红细胞裂解液去除红细胞红细胞裂解液去除红细胞原理：红细胞裂解液成分为低渗的原理：红细胞裂解液成分为低渗的NH4Cl溶液，利用双溶液，利用双凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点，凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点，加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。2.1.4 培养细胞单细胞悬液制备培养细胞

38、单细胞悬液制备2.1.5 体液脱落细胞样本制备体液脱落细胞样本制备悬浮生长细胞悬浮生长细胞吸管反复吹打吸管反复吹打贴壁生长细胞贴壁生长细胞消化处理消化处理离心获得单离心获得单细胞悬液细胞悬液洗脱液洗脱液尿液尿液胸腹水胸腹水离心收集细胞，离心收集细胞，用生理盐水或用生理盐水或PBS洗涤洗涤3次次300目尼龙膜目尼龙膜过滤后离心过滤后离心沉淀去上清沉淀去上清单细胞单细胞悬液悬液FCM可检测下列细胞成分：可检测下列细胞成分： 表面标记物表面标记物 胞浆标记物胞浆标记物 核内标记物核内标记物 可溶性成分可溶性成分2.2 免疫荧光染色免疫荧光染色黏附因子黏附因子表面受体表面受体细胞因子细胞因子分泌到胞外

39、的分泌到胞外的细胞因子细胞因子胞内抗原胞内抗原核酸含量核酸含量核内抗原核内抗原 荧光素偶联抗体荧光素偶联抗体 抗体上偶联荧光素抗体上偶联荧光素(FITC、PE等等)，通过，通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光。上荧光。 染色过程即抗原抗体反应过程。染色过程即抗原抗体反应过程。 荧光染料荧光染料/荧光化合物荧光化合物 PI、DAPI等插入核酸链中；等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；和蛋白质共价结合； Annexin V-FITC检测凋亡。检测凋亡。 荧光蛋白荧光蛋白 如如GFP，不需要染色，直接检测。，不需要染色，直接检测。 免疫荧光染色主要包括直

40、接和间接免疫荧光染色两种方法。免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。比高，所以一般首先直标荧光抗体。荧光抗体荧光抗体荧光二抗荧光二抗第一抗体第一抗体直接标记直接标记间接标记间接标记 一般检测时，获取一般检测时，获取12万个细胞，标记万个细胞，标记0.51106细胞即细胞即可。可。 下述情况细胞量需相应增加：检测胞内下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本次数多；细胞周期乙醇固定

41、损失细胞多；检测细胞在标本中比例低中比例低 0.51106个细胞个细胞孵育体积孵育体积50-100ul上机体积上机体积200-500ul终浓度约终浓度约1106个个/ml加染料加染料洗涤后补洗涤后补加液体加液体细胞表面抗原标记细胞表面抗原标记 表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。也相对简单。 标记：取标记：取0.51106细胞，加入适量抗体细胞，加入适量抗体(根据抗体说根据抗体说明书明书)，充分混匀后，充分混匀后(总体积总体积50-100ul)， 4 避光孵育避光孵育10-30min。 洗涤：加入洗涤：加入1ml PBS洗液，洗液，3

42、00g离心洗涤离心洗涤5min。 上机检测：弃去上清后加入上机检测：弃去上清后加入200-500ul PBS，重悬细胞，重悬细胞后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体积的体积的1%多聚甲醛，混匀后置于多聚甲醛，混匀后置于4 冰箱内保存，一冰箱内保存，一般不超过般不超过24h。胞内抗原荧光标记胞内抗原荧光标记 细胞内抗原：如细胞内抗原：如MPO； 核内抗原：如核内抗原：如FoxP3； 细胞内细胞因子细胞内细胞因子(胞内因子胞内因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。等。 固定：固定：4多聚甲醛多聚甲醛 破膜破膜/透化透化 0.05%皂素

43、皂素(saponin)； 0.01% Triton X-100 70% 乙醇乙醇 膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本，充分混匀后避光孵育细胞标本，充分混匀后避光孵育10-30min。 洗涤：加洗涤：加1ml PBS洗液，洗液，300g离心离心5min。 固定：去上清后加入固定：去上清后加入500ul 4%多聚甲醛，固定多聚甲醛，固定20min。 透化：离心洗去固定剂后，加皂素透化：离心洗去固定剂后，加皂素500 ul，透化，透化10min。 胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素标记胞内抗原染色：离心洗去透化液后

44、，加入相应荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育抗体，混匀后室温避光孵育30 min。 洗涤：加洗涤：加1ml PBS洗液，洗液，300g离心离心5min。 上机检测：弃去上清后加入上机检测：弃去上清后加入PBS 200-500 ul后上机检测。后上机检测。2.3 对照的设置对照的设置 空白对照空白对照 细胞内物质自身也发出荧光，能被细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。 设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特

45、异性荧光，避免假阳性的结果。光和特异性荧光，避免假阳性的结果。 流式结果中荧光强弱是一个相对流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。信号越强；电压越小，信号越弱。 通过调节电压，使阴性对照管的通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。组的荧光值都是相对对照组。001001002阳性对照阳性对照Positive Control 设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置：分析时都必须

46、设置： 使用新的荧光素抗体时；使用新的荧光素抗体时； 使用存储时间较长的荧光素抗体时。使用存储时间较长的荧光素抗体时。 设置阳性对照的方法：设置阳性对照的方法： 用肯定表达有该抗原的细胞来检测；用肯定表达有该抗原的细胞来检测； 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。单标对照单标对照Single Staining Control 两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节；两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节； 单标实验时不需要。单标实验时不需要。2.4 光谱重叠与补偿光谱重叠与补偿当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，

47、理论上可选择滤当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是染料都是宽发射谱宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是这种现象就是光谱重叠光谱重叠(spectral overlap)。FL1 530/30FL2 585/42发射波长FITC发射谱PE发射谱 实验操作中

48、，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿(fluorescence compensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1 - %FL2补偿前补偿前补偿后补偿后FITC单标单标PE 单标单标未补偿未补偿正确补偿正确补偿FITC-PE补偿太大补偿太大PE-FITC补偿太大补偿太大补偿调节要合适补偿调节要合适三、流式细胞

49、术的应用三、流式细胞术的应用细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能在上述分析基础上进行分选在上述分析基础上进行分选 3.1 检测细胞周期检测细胞周期 3.2 检测细胞凋亡检测细胞凋亡 3.3 检测细胞增殖检测细胞增殖 3.4 免疫细胞亚型检测免疫细胞亚型检测 3.5 检测细胞因子检测细胞因子 3.6 检测细胞吞噬功能检测细胞吞噬功能 3.7 流式分选流式分选3.1 检测细胞周期检测细胞周期 处于不同细胞周期的细胞处于不同细胞周期的细胞DNA含含量不同，量不同，G

50、0/G1期细胞含有二倍体期细胞含有二倍体量的量的DNA，G2/M期细胞含有四倍期细胞含有四倍体量的体量的DNA，而，而S期细胞期细胞DNA含量含量处于二倍体和四倍体量之间。处于二倍体和四倍体量之间。DNA Content DNA荧光染料能与荧光染料能与DNA结合，结合，DNA含量的多少与含量的多少与荧光染料的结合量荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了成正比，荧光强度反应了DNA吸吸收荧光分子的多少。通过流式检收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内测就能反映细胞内DNA的含量，的含量，区分细胞周期的区分细胞周期的G0/G1期、期、S期和期和G2/M期细胞比例。期细胞比例。 细胞周期分析核

51、酸染料细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶碘化丙啶)、EB(溴化乙啶溴化乙啶)，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。加细胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：细胞膜通透性染料：DAPI、Hoechst，能染活细胞的，能染活细胞的DNA，但需紫外激光激发。，但需紫外激光激发。 PI标记法标记法检测细胞周期检测细胞周期 需要乙醇固定增加细胞膜的通透性；需要乙醇固定增加细胞膜的通透性； 需要加需要加RNase，去除，去除RNA对对DNA的干扰。的干扰。 PI法检测细胞周期一般步骤：法检测细胞

52、周期一般步骤： 收集单细胞悬液收集单细胞悬液(1 106个个)，缓慢加入，缓慢加入1 ml预冷的预冷的70乙醇，于乙醇，于4固定过夜，或固定过夜，或-20长期固定。长期固定。 离心收集细胞，再以离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇；彻底洗去乙醇； 去上清后加入染色液去上清后加入染色液(包含包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 染色染色30min后上机检测。后上机检测。细胞周期检测结果细胞周期检测结果脾脏细胞脾脏细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞通过流式检测，能得出通过流式检测，能得出G0/G1期、期、S期和期和G2/M期细胞比

53、例。期细胞比例。增殖指数增殖指数(proliferous index, PI)：指处于：指处于S期和期和G2/M期细胞之和占总细期细胞之和占总细胞的比例，反映了细胞的增殖能力。胞的比例，反映了细胞的增殖能力。CV值值(变异系数变异系数)：衡量仪器测量分辨率和精度的指标。：衡量仪器测量分辨率和精度的指标。DNA倍体分析倍体分析病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测DNA含量能反映异含量能反映异倍体情况。倍体情况。DNA指数指数(DNA index, DI)：(样本的样本的G0/G1期峰平均荧光道数期峰平均荧光道数)/(正常二倍正常二倍体细胞体细胞

54、G0/G1期峰平均荧光道数期峰平均荧光道数)，描述样品细胞，描述样品细胞DNA含量的偏离程度含量的偏离程度和倍体水平。和倍体水平。倍体倍体(ploidy)：染色体数目。二倍体：染色体数目。二倍体 DI=1；四倍体；四倍体 DI=2；二倍体四倍；二倍体四倍体之外统称异倍体。体之外统称异倍体。二倍体二倍体异倍体异倍体异倍体异倍体精子单倍体细胞精子单倍体细胞 双联体细胞的去除双联体细胞的去除 利用信号脉冲利用信号脉冲FL2-W/FL2-A区别标本中的粘连细胞以及碎区别标本中的粘连细胞以及碎片，最大程度的减少假阳性。片，最大程度的减少假阳性。G1双联体细胞双联体细胞G2/M细胞细胞FL2-WFL2-W

55、FL2-HFL2-HFL2-WFL2-A3.2 检测细胞凋亡检测细胞凋亡 细胞死亡方式主要有两种：包括细胞坏死细胞死亡方式主要有两种：包括细胞坏死(necrosis)和细胞和细胞凋亡凋亡(apoptosis)。 细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一种主动性的、高度有序的结束自己生命的过程。种主动性的、高度有序的结束自己生命的过程。 凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、核固缩、细胞膜卷曲、核固缩、细胞膜卷曲、DNA片段化、线粒体电位发生变化。片段化、线粒体电位发生变化。

56、根据这些特征，流式有多种方法能定性及定量的检测细胞根据这些特征，流式有多种方法能定性及定量的检测细胞凋亡情况。凋亡情况。3.2.1 亚二倍体亚二倍体(Sub-G1)峰的检测峰的检测 凋亡细胞核小体崩解，凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于含量减少，加之由于DNA的降的降解，与荧光染料的结合减少，因此解，与荧光染料的结合减少，因此DNA染料的着色能力下染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在降，荧光强度降低，表现在G1峰前出现亚二倍体峰，即亚峰前出现亚二倍体峰，即亚G1峰峰(凋亡峰凋亡峰)。细胞凋亡峰细胞凋亡峰 Sub-G1四倍体峰四倍体峰二倍体峰二倍体峰PINumber3.2.2 An

57、nexin V/PI双染法双染法正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂(如磷脂酰丝氨如磷脂酰丝氨酸酸, PS)。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，PS外翻到胞外侧。外翻到胞外侧。Annexin V是一种是一种Ca2+依赖性的对依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别膜表面是否有作为探针识别膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。，从而识别凋亡细胞。PS外翻外翻PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完

58、整的，所以PI不能不能进入早期凋亡细胞核内。进入早期凋亡细胞核内。Annexin V-FITCPI活细胞活细胞早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期凋亡坏死细胞坏死细胞裸核裸核免疫荧光图免疫荧光图C1h2h3h4h5h3.2.3 线粒体膜电位检测法线粒体膜电位检测法凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变，利用荧光探针罗丹明凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变，利用荧光探针罗丹明123(Rh123)、DiOC6和和JC-1等标记后，经过流式能检测出线粒体电位的变化，从而等标记后，经过流式能检测出线粒体电位的变化，从而反映了细胞的凋亡情况。反映了细胞的凋亡情况。JC-1在正常细胞中在胞浆以聚合体形式存在，在在正常细胞中在

59、胞浆以聚合体形式存在，在 Fl-1 和和 Fl-2 有荧光；有荧光；细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，JC-1 进入线粒体以单体形式存进入线粒体以单体形式存在，仅在在，仅在 Fl-1通道有荧光通道有荧光 。JC-1 (Fl-1)Jurkat T CellsControl CamptothecinJC-1 (Fl-2)3.2.4 DNA断裂片段的检测断裂片段的检测(TUNNEL法法) 凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活，双链的凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活，双链的DNA出现不出现不对称的断裂点，即产生一系列对称的断裂点，即产生一系列3-OH端。加入外源性的端。加

60、入外源性的脱脱氧核苷酸末端转移酶氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)能够催化外源性荧光素标记的能够催化外源性荧光素标记的dUTP连接到连接到DNA的的3-OH端，通过流式检测就能知道端，通过流式检测就能知道DNA断裂片段的多少，这断裂片段的多少，这种方法叫做种方法叫做TdT介导的介导的dUTP缺口末端标记法缺口末端标记法(TdT mediated-dUTP nick end labeling, TUNEL)。 近来研究证实，近来研究证实，Br-dUTP(BrdU)更容易掺入到凋亡细胞的更容易掺入到凋亡细胞的DNA中，所以现在