生物大分子相互作用分析新技术

1、 生物大分子相互作用分生物大分子相互作用分析新技术析新技术 1、荧光共振能量转移技术、荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）能够对于细胞中的蛋白质间相互作用或对作用进行实时原位分析的检测方法供体荧光素 受体荧光素FRET现象现象 Binding NO BindingFRET: The Size 当一个荧光分子当一个荧光分子(又称为又称为供体分子供体分子)的荧光光谱与另的荧光光谱与另一个荧光分子一个荧光分子(又称为又称为受体受体分子分子)的激发光谱相重叠时，的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发供体荧光分子的激发能诱发

2、受体分子发出荧光，同时供受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度体荧光分子自身的荧光强度衰减。衰减。FRET 程度与供、受程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，体分子的空间距离紧密相关，一般为一般为710 nm 时即可发时即可发生生FRET；随着距离延长，；随着距离延长，FRET呈显著减弱呈显著减弱.实验设计实验设计InteractionXCFPYYFPUV laserFRETYellow light emissionYYFPXCFPUV laserCyan light emissionDonorAcceptorFRET的能量供体和受体的能量供体和受体满足条件：满足条件： 供体受体的激

3、发光谱要分得足够开；供体受体的激发光谱要分得足够开； 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠；供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠； 供受体的发射光谱要足够分开。供受体的发射光谱要足够分开。CFPYFPWavelength (nm)Normalized intensity (%)GFP 绿绿 色色 荧荧 光光 蛋蛋 白白CFP (青色荧光蛋白青色荧光蛋白)(第第66位位TyrTrp)(第第203位位ThrTyr)YFP (黄色荧光蛋白黄色荧光蛋白)CFP (433nm /476nm) YFP (513nm / 527nm)FRET的能量供体和受体的能量供体和受体 均相检测（无分离和洗涤步骤）均相

4、检测（无分离和洗涤步骤） 实时连续地观察活细胞的动态变化实时连续地观察活细胞的动态变化FRET技术的优势技术的优势Fluorescence IntensityTime LigandCy3Cy5ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET应用的类型应用的类型FRET应用范围应用范围 酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证 蛋白质蛋白质核酸相互作用核酸相互作用 酶活性分析酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白酶、磷酸激酶 钙流检测、离子通道研究钙流检测、离子通道研究 蛋白质的结构研究蛋白质的结构

5、研究FRET应用的局限性应用的局限性 信噪比经常不佳，通常为信噪比经常不佳，通常为1：1 -背景主要来自受体被直接激发的信号背景主要来自受体被直接激发的信号 检测仪器的灵敏度、分辨率以及计算机影像采集和检测仪器的灵敏度、分辨率以及计算机影像采集和分析软件的能力分析软件的能力2、表面等离子共振技术、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）适合于多种类型分子并且无需借助标记物可以实现对复合物直接实时测定的方法 SPRimagerII 基本原理：基本原理：基于表面等离子共振（基于表面等离子共振（SPR）技术）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记来

6、实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。解离整个过程的变化。SPR 现象现象SPR angle450 gold layerp-PolarizedLight 表面等离子共振（表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率

7、的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为全消失的入射角称为SPR角。角。SPR随表面折射率的变化而变化，而随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变

8、化，角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 SPR 角度角度扫描曲线扫描曲线SPR angle传统检测原理传统检测原理SPR angle shift as basis of measurementSPR imaging 检测原理检测原理Fixed angle, fixed wavelengthD%RReflectivity change as basis of measurementSPRimager 系统系统Rotating Stage流动相流动相（含待分析物）（含待分析物）Gold-coated glassSPRchipp-pol lig

9、ht棱镜棱镜分子探针阵列分子探针阵列GWCs “SPR Imaging” 技术技术Bioarray TerminologySPRchipglassgoldattachment chemistryBiosensorAnalyteProbeMonitoring Changes: Difference Images=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbe ArrayProbe Array + BiotinT7Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to StreptavidinABAB-Monitoring Changes:

10、Image + ChartValue of Real-Time MonitoringProtein Array,End of ExperimentAg SA ConAdd Biotinylated AntibodyD D%RminEnd-point measurements miss all the action 优点：优点：分子无需标记；分子无需标记； 高通量（蛋白质芯片）高通量（蛋白质芯片） 检测对象类型广泛检测对象类型广泛 可实现实时检测可实现实时检测 可进行相互作用动力学分析可进行相互作用动力学分析SPRimager 系统系统灵活的阵列形式灵活的阵列形式 Rapid methods d

11、evelopment Manual spottingno spottingrobot needed Small probe volumes SpotReady, 16 or 25 spots SPRchip 1 - 400 spots Higher density arrays Higher throughput Spotting robot needed样品无需标记样品无需标记particularly valuable for protein biology Protein moleculeProtein molecule, labelled 避免引入标签带来的人为干扰避免引入标签带来的人为干扰 Detect in real time, measure molecular affinities Multiplex analysis from a