酶工程第九章酶分子修饰

1、n 限制酶大规模应用的原因限制酶大规模应用的原因1. 易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；2. 容易受产物和抑制剂的抑制；容易受产物和抑制剂的抑制；3. 底物不溶于水，或酶的米氏常数过高；底物不溶于水，或酶的米氏常数过高；4. 酶做为药物在体内的半衰期较短；酶做为药物在体内的半衰期较短；5. 已知酶种类及产物有限。已知酶种类及产物有限。1. 通过通过分子修饰分子修饰的方法来改变已分离出来的天然的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。酶的活性。蛋白质水平蛋白质水平2. 通过通过基因工程基因工程方法改变编码酶分子的基因而达方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的

2、目的。到改造酶的目的。核酸水平核酸水平n 改变酶特性的两种主要方法改变酶特性的两种主要方法n 酶分子修饰：酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结通过各种方法使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的催化特性的技术。构发生改变，从而改变酶的催化特性的技术。主要内容主要内容 一、活性中心的概念一、活性中心的概念酶分子中的一小部分区域酶分子中的一小部分区域v 由酶分子中少数氨基酸残基参与组成由酶分子中少数氨基酸残基参与组成v 与底物发生结合和催化作用与底物发生结合和催化作用v 与酶活力直接相关与酶活力直接相关 第一节第一节 酶的活性中心（酶的活性中心（active center）二、酶活性中心的共性二、酶活

3、性中心的共性 1. 酶的活性中心是由酶的活性中心是由必需基团必需基团(essential group)构构成的成的与酶催化活性有关的特定区域，与酶催化活性有关的特定区域，其构象其构象不不是固定不变的（诱导契合）是固定不变的（诱导契合）。uThe active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. 酶酶分分子子非必需基团非必需基团必需基团必需基团活性中心活性中心必需基团必需基团活性

4、中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心u 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高: Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr、Seru某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基和羟某些功能基团（如氨基、羧基、巯基、咪唑基和羟基）是酶的基）是酶的必需基团必需基团。 活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNHH2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH

5、2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH半胱氨酸半胱氨酸谷氨酸谷氨酸丝氨酸丝氨酸组氨酸组氨酸天冬氨酸天冬氨酸赖氨酸赖氨酸酪氨酸酪氨酸2. 活性部位只占酶分子活性部位只占酶分子很小的一部分（很小的一部分（1-2%）。3. 活性部位是一个活性部位是一个三维实体三维实体。u The active site is often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.4. 活性中心位于酶分子表面的活性中心位于酶分子表

6、面的疏水性裂缝疏水性裂缝中。中。 5. 酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等等次级键次级键结合。结合。1. 物理学方法物理学方法2. 化学修饰法化学修饰法3. 动力学参数法动力学参数法4. 蛋白质工程蛋白质工程 三、研究酶活性中心的方法三、研究酶活性中心的方法u 用用X射线衍射法射线衍射法直接检直接检测底物或其类似物与酶测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位括酶和底物）的相对位置。置。 1. 物理学方法物理学方法2. 化学修饰法化学修饰法u根据所用修饰试剂不同，分为根据所用修饰试剂不同，分为: 1) 非

7、专一性化学修饰非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。u若修饰后：若修饰后： 酶活性不变酶活性不变修饰基团可能不是酶的必需基团修饰基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失酶活性降低或丧失修饰基团可能是酶的必需基修饰基团可能是酶的必需基团，但不能确定是否同活性中心内的必需基团结合。团，但不能确定是否同活性中心内的必需基团结合。2) 专一性化学修饰专一性化学修饰u 基团专一性修饰基团专一性修饰 用专一性化学修饰剂修饰酶分子中的用专一性化学修饰剂修饰酶分子中的某一特定氨某一特定氨基酸残基基酸残基的侧链基团。的侧链基团。u位点专一性修饰位

8、点专一性修饰 (亲和标记）亲和标记） 利用利用酶对底物的特殊亲和力酶对底物的特殊亲和力修饰酶分子修饰酶分子活性中心活性中心的的某一特定氨基酸残基的侧链基团。某一特定氨基酸残基的侧链基团。u 亲和修饰剂：亲和修饰剂：与与底物结构底物结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。小。具有活泼的化学基团具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。的基团形成稳定的共价键。亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰）化学修饰的专一性化学修饰的专一性3

9、. 动力学参数法动力学参数法u pH-酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需酶活力关系的研究，可得到参与反应的必需基团的基团的pK值，通过比较分析估计基团的种类。值，通过比较分析估计基团的种类。4. 蛋白质工程蛋白质工程u 将酶相应的将酶相应的cDNA定点突变定点突变，突变的，突变的cDNA只表达只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。知被置换的氨基酸是否为活力所必需。一、一、 酶分子修饰的目的酶分子修饰的目的1. 研究酶的结构与功能的关系（上世纪研究酶的结构与功能的关系（上世纪50年代）年代）探测酶活性必

10、需氨基酸的性质和数目探测酶活性必需氨基酸的性质和数目酶蛋白一级结构的测定酶蛋白一级结构的测定酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白的结构变化与运动酶蛋白部分区域的构象状态酶蛋白部分区域的构象状态酶的作用机理与催化反应历程酶的作用机理与催化反应历程酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态酶的固定化技术酶的固定化技术酶纯度的分析与检测酶纯度的分析与检测第二节第二节 酶分子修饰的目的和原理酶分子修饰的目的和原理2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围（上世纪范围（上世纪70年代）年代）1. 提高酶的生物活性（酶活力）提高酶的生物

11、活性（酶活力）2. 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）3. 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）4. 产生新的催化能力产生新的催化能力第三节第三节 酶分子修饰的种类酶分子修饰的种类一、金属离子置换修饰一、金属离子置换修饰二、酶分子的化学修饰二、酶分子的化学修饰三、酶分子的物理修饰三、酶分子的物理修饰一、金属离子置换修饰一、金属离子置换修饰 P136（metal ion substitute modification）u 将酶分子中的金属离子置换为另一种金属离将酶分子中的金属离子置换为另一种金属离子，使

12、其催化特性发生改变的修饰方法。子，使其催化特性发生改变的修饰方法。1. 方法：方法：u 酶的分离纯化酶的分离纯化u 除去原有金属离子：加入除去原有金属离子：加入金属螯合剂，金属螯合剂，去除去除螯合物螯合物u 加入置换离子加入置换离子 2. 作用：作用：u阐明金属离子对酶催化作用的影响阐明金属离子对酶催化作用的影响u提高酶的催化效率提高酶的催化效率u增强酶的稳定性增强酶的稳定性u 改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性1. 酶的表面化学修饰酶的表面化学修饰（1）大分子结合修饰）大分子结合修饰（2）侧链基团修饰（侧链基团修饰（小分子修饰小分子修饰）（3）交联法）交联法（4）固定化修饰（共价结合法）固

13、定化修饰（共价结合法）2. 酶分子内部修饰酶分子内部修饰（1）肽链有限水解修饰）肽链有限水解修饰（2）核苷酸链剪切修饰）核苷酸链剪切修饰（3）氨基酸置换修饰）氨基酸置换修饰（4）核苷酸置换修饰）核苷酸置换修饰二、酶分子的化学修饰二、酶分子的化学修饰（1）大分子结合修饰）大分子结合修饰 P138（macro molecules combine modification）n 利用利用水溶性大分子水溶性大分子与酶的侧链基团结合，使酶的空与酶的侧链基团结合，使酶的空间结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。间结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。 n 修饰剂：修饰剂： 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG

14、）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextran）、肝素）、肝素（heparin）、糖肽（）、糖肽（glycopeptide）等。）等。n 修饰方法：修饰方法： 修饰剂选择，修饰剂活化，修饰，分离。修饰剂选择，修饰剂活化，修饰，分离。 聚乙二醇的修饰反应聚乙二醇的修饰反应 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG， Mw 1000-10000）：线性大分子，：线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性。无残留、无免疫原性。 单甲氧基聚乙二醇（单甲氧基聚乙二醇（MPEG）：）： CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH 修饰方法：

15、修饰方法：重氮法、叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均重氮法、叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均三嗪法三嗪法。重氮法重氮法叠氮法叠氮法琥珀酸酐法琥珀酸酐法三氯三嗪法三氯三嗪法例：聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶（例：聚乙二醇化学修饰超氧化物歧化酶（SOD） 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)：生物体内重要的自由基：生物体内重要的自由基清除剂，催化超氧阴离子清除剂，催化超氧阴离子(O2-)的歧化反应，能缓的歧化反应，能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织缺血解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。性损伤，预防和治疗辐射损伤。 临床应用临床应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除：

16、延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及辐射防护。性关节炎及辐射防护。 缺陷缺陷：半衰期短、稳定性差、免疫原性。：半衰期短、稳定性差、免疫原性。u SOD作用机制作用机制修饰方法修饰方法 修饰剂选择：单甲氧基修饰剂选择：单甲氧基PEG (mPEG) 修饰剂活化：烷基化修饰剂活化：烷基化 修饰：活化后的修饰剂与蛋白上赖氨酸残基的修饰：活化后的修饰剂与蛋白上赖氨酸残基的-氨基或氨基或N末端氨基反应，形成稳定的连接体末端氨基反应，形成稳定的连接体 分离：凝胶层析分离：凝胶层析 效果：抑制免疫反应的产生，提高抗酶水解

17、能力，效果：抑制免疫反应的产生，提高抗酶水解能力，延长半衰期延长半衰期修饰原理修饰原理 PEG与蛋白的非必需基团结合后，分子表面形成与蛋白的非必需基团结合后，分子表面形成一个一个PEG保护层，作为一种屏障挡住蛋白分子表保护层，作为一种屏障挡住蛋白分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原面的抗原决定簇，避免抗体的产生或者阻止抗原和抗体的结合而和抗体的结合而抑制免疫反应的产生抑制免疫反应的产生。 由于这种保护层的形成保护了该酶免受体内水解由于这种保护层的形成保护了该酶免受体内水解酶的消化，表现了较强的酶的消化，表现了较强的抗酶水解能力抗酶水解能力。 蛋白经蛋白经PEG修饰后分子量增加，分子

18、的体积增大，修饰后分子量增加，分子的体积增大，肾小球过滤减少，可以避免被肾脏很快地排除，肾小球过滤减少，可以避免被肾脏很快地排除，因而其血浆存留时间得到显著延长，有助于蛋白因而其血浆存留时间得到显著延长，有助于蛋白药物循环药物循环半衰期的延长半衰期的延长。 糖类的修饰反应：糖类的修饰反应：右旋糖苷修饰反应右旋糖苷修饰反应 右旋糖苷：右旋糖苷： -葡萄糖通过葡萄糖通过 -1, 6-糖苷键连接而成，糖苷键连接而成，双羟基双羟基经过活化后可与酶分子上的经过活化后可与酶分子上的游离氨基游离氨基相结合。相结合。 修饰方法：修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法溴化氰法、高碘酸氧化法。-NH2糖肽（糖肽（Gly

19、copeptide）的修饰反应）的修饰反应: 糖肽：人纤维蛋白或糖肽：人纤维蛋白或 -球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，分子上的子上的游离氨基游离氨基活化后可与酶分子上的活化后可与酶分子上的氨基氨基反应。反应。 修饰方法：修饰方法：异氰酸法、戊二醛法。异氰酸法、戊二醛法。聚乳糖修饰反应：聚乳糖修饰反应： 聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上酶分子上氨基氨基反应。反应。 其他合成大分子多聚物的修饰反应其他合成大分子多聚物的修饰反应(1) 聚聚N - 乙烯吡硌烷酮乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为用水溶性

20、的分子量为10,000的的PVP，经过开环水解活化后，与酶结合。，经过开环水解活化后，与酶结合。(2) 聚乙烯醇聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。基共价连接。(3) 聚丙烯酸聚丙烯酸(PAA):用分子量为用分子量为250,000的的PAA，经过，经过N - 羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。(4) 聚顺丁烯二酸酐聚顺丁烯二酸酐:用分子量为用分子量为98,000的聚顺丁烯二酸的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发

21、生反应。酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。(5) 聚氨基酸：聚氨基酸：用分子量为用分子量为5,700的聚赖氨酸做修饰剂的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可联。用丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。以与酶发生反应。 天然大分子对酶的修饰反应天然大分子对酶的修饰反应肝素肝素n由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为为20000，是一种含硫酸酯的黏多糖。，是一种含硫酸酯的黏多糖。 经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以

22、经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血抗血凝、抗血栓、降血脂脂等活性。等活性。 修饰方法修饰方法：三氯三嗪法、溴化氰法：三氯三嗪法、溴化氰法 天然大分子对酶的修饰反应天然大分子对酶的修饰反应人血清白蛋白：人血清白蛋白：包含包含585个氨基酸，分子量为个氨基酸，分子量为66kD 临床应用临床应用：治疗休克与烧伤，用于补充因手术、：治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂血浆增容剂 修饰方法修饰方法：戊二醛法、活性酯法：戊二醛法、活性酯法提高酶的

23、催化效率提高酶的催化效率u水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合后，一水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合后，一定程度上改变了定程度上改变了酶的空间构象酶的空间构象，有利于活性中，有利于活性中心与底物结合并发挥催化作用心与底物结合并发挥催化作用大分子结合修饰的作用大分子结合修饰的作用n 增强酶天然构象的稳定性与耐热性增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂与修饰剂与酶形成多点交联，使酶的天然构象酶形成多点交联，使酶的天然构象 “刚性刚性”增加。增加。n 保护酶活性部位与抗抑制剂保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂产大分子修饰剂产生的生的空间障碍空间障碍或或静电斥力静电斥力阻挡抑制剂。阻挡抑制剂。n 维持

24、酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶大大分子修饰剂产生分子修饰剂产生空间障碍空间障碍阻挡蛋白水解酶；阻挡蛋白水解酶；敏感基敏感基团团交联上修饰剂后受蛋白水解酶破坏的可能性减小。交联上修饰剂后受蛋白水解酶破坏的可能性减小。n 稳定酶的微环境稳定酶的微环境大分子修饰剂（多聚电荷体）大分子修饰剂（多聚电荷体）在酶分子表面形成在酶分子表面形成“缓冲外壳缓冲外壳”增强酶的稳定性增强酶的稳定性n 酶蛋白氨基酸组成的酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇抗原决定簇，与修饰剂形成，与修饰剂形成了共价键。了共价键。 破坏破坏了抗原决定簇了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 遮盖

25、遮盖了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合降低或消除酶蛋白的抗原性降低或消除酶蛋白的抗原性大分子结合修饰的应用大分子结合修饰的应用u PEG-超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）u PEG-溶血类蛋白质（链激酶溶血类蛋白质（链激酶Streptokinase, SK;尿激酶尿激酶urokinase, UK等）等）u PEG-天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（Asparaginase, ASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期u 用用Dextran修饰修饰 -淀粉酶，淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋

26、白酶、淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。（2）侧链基团修饰（侧链基团修饰（小分子修饰小分子修饰 ）P141（side residues modification）u通过化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变，从而改通过化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。变酶的催化特性的修饰方法。u 侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基等氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基等。u 20种不同氨基酸的侧链基团中只有种不同氨基酸的侧链基团中只

27、有极性氨基酸极性氨基酸的侧的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。链易被修饰，它们一般具有亲核性。u 侧链基团修饰剂：侧链基团修饰剂：小分子化合物小分子化合物 根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R基的极性，基的极性，20种氨基酸可分成种氨基酸可分成4类类。u 非极性非极性R基氨基酸基氨基酸（共（共9种）：种）： 甘氨酸甘氨酸 (Glycine, Gly, G) 丙氨酸丙氨酸 (Alanine, Ala, A) 亮氨酸亮氨酸 (Leucine, Leu, L) 缬氨酸缬氨酸 (Valine, Val, V) 异亮氨酸异亮氨酸 (Isoleucine, Ile, I) 苯丙氨酸苯丙氨酸 (Phenylala

28、nine, Phe, F) 脯氨酸脯氨酸 (Proline, Pro, P) 色氨酸色氨酸 (Tryptophan, Trp, W) 甲硫氨酸甲硫氨酸 (Methionine, Met, M)u 无电荷的极性无电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共6种）：种）： 丝氨酸丝氨酸 (Serine, Ser, S) 苏氨酸苏氨酸 (Threonine, Thr, T) 酪氨酸酪氨酸 (Tyrosine, Tyr, Y) 半胱氨酸半胱氨酸 (Cysteine, Cys, C) 天冬酰胺天冬酰胺 (Asparagine, Asn, N) 谷氨酰胺谷氨酰胺 (Glutamine, Gln, Q) u带正电荷

29、的极性带正电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共3种）：种）： 赖氨酸赖氨酸 (Lysine, Lys, K), 精氨酸精氨酸 (Arginine, Arg, R), 组氨酸组氨酸 (Histidine, His, H)u带负电荷的极性带负电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共2种）：种）： 天冬氨酸天冬氨酸 (Aspartic acid, Asp, D), 谷氨酸谷氨酸 (Glutamic acid, Glu, E)烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应几种重要的修饰反应几种重要的修饰反应烷基化反应烷基化反应 试剂特点：试剂特点：烷基上带烷基上带

30、活泼卤素活泼卤素，导致酶分子的亲，导致酶分子的亲核基团（如核基团（如-NH2，-SH等）发生烷基化。等）发生烷基化。 可作用基团：可作用基团： 氨基（氨基（Lys），胍基（），胍基（Arg），巯基（），巯基（Cys），羧），羧基（基（Asp、Glu），咪唑基（），咪唑基（His）。）。 修饰剂：修饰剂：2, 4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应烷基化反应酰基化反应酰基化反应 试剂特点：试剂特点： 含有含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。使之酰基化。 可作用基团：可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（氨基，

31、巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（），酚羟基（Tyr）修饰剂：修饰剂： 乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等酰基化反应酰基化反应氧化和还原反应氧化和还原反应 试剂特点：试剂特点：具有具有氧化性氧化性或或还原性还原性。 氧化剂：氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基、甲硫基、吲哚基、可被氧化的侧链基团：巯基、甲硫基、吲哚基、咪唑基、酚基等。咪唑基、酚基等。 还原剂：还原剂：2-巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。 可被还原的侧链基团：二硫键。可被还原的侧链基团：二硫键。连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DT

32、T还原逆回，用于还原逆回，用于保护巯基保护巯基。芳香环取代反应芳香环取代反应u 试剂：卤（碘）化、硝化试剂试剂：卤（碘）化、硝化试剂 （四硝基甲烷）（四硝基甲烷）I2 + HI (NO2)4C + +(NO2)3CH特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰氨基的化学修饰氨基的化学修饰：u来源：来源：Lysu修饰反应：修饰反应：酰基化、烷基化酰基化、烷基化u修饰剂修饰剂: 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）、）、2, 4-二硝基氟苯二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸

33、碘乙酸羧基的化学修饰羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。 常用常用水溶性碳二亚胺水溶性碳二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目。测定酶分子中羧基的数目。+碳二亚胺碳二亚胺巯基的化学修饰巯基的化学修饰 来源：来源：Cys 修饰反应修饰反应: 烷基化烷基化 修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸 (IAA) 碘乙酰胺碘乙酰胺 (IAM) E-SH + R-X E-S-R +HXN-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEM）：常用的专一修饰巯基试）：常用的专一修饰巯基试剂剂E-SH + 胍基的化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：Arg修

34、饰反应：修饰反应：本质上是本质上是羰基羰基对对氨基氨基酰基化酰基化。修饰剂：修饰剂： 丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1，2-环己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛酚羟基的化学修饰酚羟基的化学修饰来源：来源：Tyr修饰反应：修饰反应：芳香环取代反应芳香环取代反应修饰剂：修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）碘、硝化试剂（四硝基甲烷）I2 + HI 咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：His 修饰反应修饰反应: 酰基化、烷基化酰基化、烷基化 酰基化酰基化修饰剂修饰剂: 焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化烷基化

35、修饰剂：修饰剂：碘乙酸碘乙酸 + ICH2COOH + HI吲哚基的化学修饰吲哚基的化学修饰 来源：来源：Trp 修饰反应：修饰反应：氧化反应氧化反应 修饰剂：修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原：还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂Lys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2，4-二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp/Glu羧基羧基水溶性碳二亚胺水溶性碳二亚胺Arg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,2-环己二酮、丁二酮环己二酮、丁

36、二酮Cys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷Trp吲哚基吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂u 对修饰效果的解释须十分小心：对修饰效果的解释须十分小心： 任何一种修饰剂任何一种修饰剂不是绝对专一不是绝对专一的。的。 有些修饰剂引起蛋白质构象变化有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，失活， 不一不一定是活性中心基团被共价修饰定是活性中心基团被共价修饰。 不同部分的相同基团

37、，修饰效果不同不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部，分子内部的必需基团不易被修饰。的必需基团不易被修饰。（3）交联法）交联法（crosslinking modification） 分子内交联分子内交联：利用：利用双功能试剂双功能试剂与酶分子中邻近的侧与酶分子中邻近的侧链基团之间形成共价交联。链基团之间形成共价交联。 分子间交联分子间交联：借助借助双功能试剂双功能试剂使酶分子之间发生共使酶分子之间发生共价交联。价交联。 形成杂化酶形成杂化酶例：用戊二醛交联胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以降例：用戊二醛交联胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂低胰凝乳蛋白酶

38、的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型，可酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型，可在体内将它们输送到同一部位而提高药效。在体内将它们输送到同一部位而提高药效。（4）固定化修饰（共价结合法）固定化修饰（共价结合法）（ covalent binding modification）n通过酶表面的极性氨基酸残基，将酶共价连接通过酶表面的极性氨基酸残基，将酶共价连接到到水不溶性载体水不溶性载体上，由于酶所处的微环境发生上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生、最适温度和稳定性发生改变。改变。（1）肽链有限水解修饰）肽链

39、有限水解修饰 P146（peptide chain linit hydrolysis modification） 在酶分子主链的特定部位进行水解，使酶分子在酶分子主链的特定部位进行水解，使酶分子的化学结构及其空间结构发生改变，从而改变的化学结构及其空间结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶的特性和功能的方法。 采用采用酶法酶法 酶切酶切/酶原激活法（用专一性较强的酶原激活法（用专一性较强的蛋白酶或肽蛋白酶或肽酶酶为修饰剂）。为修饰剂）。u 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以三种情况：酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以三种情况：1. 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏

40、，酶失去催化功能。2. 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3. 有利于活性中心的形成及与底物结合并形成准有利于活性中心的形成及与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。确的催化部位，酶活力提高。u 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称称肽链有限水解。肽链有限水解。 应用实例应用实例1）提高酶活力：）提高酶活力：u 胃蛋白酶原的激活胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（从从N N端端失失去去4 44 4个个氨氨基基酸酸残残基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶u 天门冬氨酸酶切除天门

41、冬氨酸酶切除10个氨基酸残基，可使其活力个氨基酸残基，可使其活力提高提高4-5倍。倍。胰蛋白酶原（胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活）的激活 2）消除抗原性）消除抗原性 大分子外源蛋白抗原性较强，经肽链有限水解，大分子外源蛋白抗原性较强，经肽链有限水解，降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。降低分子量，抗原性显著降低，甚至消失。 木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去了了2/3肽链，酶活性不变，抗原性大大降低。肽链，酶活性不变，抗原性大大降低。（2）核苷酸链剪切修饰）核苷酸链剪切修饰 P147（nucleotide chain cleara

42、ge modification） 核酸类酶（核酸类酶（R酶）酶） I型内含子型内含子 剪接型核酶剪接型核酶 II型内含子型内含子 锤头核酶锤头核酶 剪切型核酶剪切型核酶 发夹核酶发夹核酶 自体催化自体催化 丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDV)核酶核酶 RNaseP 异体催化异体催化n在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的催化特性。改变，从而改变酶的催化特性。u 肽链上氨基酸发生置换，引起酶蛋白空间构象的肽链上氨基酸发生置换，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。改变，从而改变酶的某些特性和功能。u作用作用：提高

43、酶的催化效率、增强酶的稳定性，改：提高酶的催化效率、增强酶的稳定性，改变酶的催化专一性变酶的催化专一性 u方法方法：化学修饰法、蛋白质工程：化学修饰法、蛋白质工程（3）氨基酸置换修饰）氨基酸置换修饰 P148（aminoacid substitute modification）化学修饰法化学修饰法 例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心例：利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的的丝氨酸丝氨酸转换为转换为半胱氨酸半胱氨酸，修饰后，该酶失去对，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。酯等底物水解的活性。 化学修

44、饰法难度大，成本高，专一性差，而且要化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。生产。蛋白质工程：蛋白质工程：利用利用定点突变定点突变技术。技术。u基因序列分析基因序列分析u蛋白质结构分析蛋白质结构分析u酶活性中心分析酶活性中心分析u引物设计进行基因定点突变引物设计进行基因定点突变u酶基因克隆表达酶基因克隆表达u变异特性分析变异特性分析（4）核苷酸置换修饰）核苷酸置换修饰 P150（nucleotide substitued modification） 将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸置换为另一将酶分子核苷

45、酸链上的某一个核苷酸置换为另一个核苷酸，从而改变酶的催化性质的修饰方法。个核苷酸，从而改变酶的催化性质的修饰方法。 方法：方法：定点突变定点突变三、酶分子的物理修饰（三、酶分子的物理修饰（physical modification） 通过各种通过各种物理方法物理方法使酶分子的空间构象发生改变，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。从而改变酶的催化特性的修饰方法。 特点：不改变酶的组成单位及共价键特点：不改变酶的组成单位及共价键 方法：高压、变性剂等方法：高压、变性剂等第四节第四节 修饰酶的化学性质修饰酶的化学性质一、热稳定性一、热稳定性u 一般提高一般提高u原因：修饰试剂

46、的多个功能基团与酶分子的多原因：修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性酶分子构象的稳定性（表（表1）。）。二、抗原性二、抗原性u 修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好（表面效果较好（表2）。）。三、对各类失活因子的抵抗力三、对各类失活因子的抵抗力:u 化学修饰酶与天然酶相比，对蛋白酶、抑制剂等化学修饰酶与天然酶相比，对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表失活因子的抵抗力均有不同程度

47、的提高（表3）。）。四、修饰酶在体内的半衰期：四、修饰酶在体内的半衰期：u多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（表多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（表4） 。五、最适五、最适pHu 大多数酶经化学修饰后，最适大多数酶经化学修饰后，最适pH发生了变化，发生了变化，这在应用上具有重要意义（表这在应用上具有重要意义（表5） 。六、六、Km 的变化的变化u 有些酶经化学修饰后，有些酶经化学修饰后，Km变大，这可能是由变大，这可能是由于屏蔽效应引起的。（表于屏蔽效应引起的。（表6）第五节第五节 酶分子修饰的应用酶分子修饰的应用一、酶化学修饰的应用一、酶化学修饰的应用n 酶学研究方面：酶学研究方面：1

48、. 研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；究；2. 确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的功能；3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量。测定酶分子中某种氨基酸的数量。n 医药方面：医药方面：提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。n工业方面：工业方面：提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐受性，改变酶的底物专一性和最适耐受性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶等酶学性质。学性质。 n抗体酶和核酸类

49、酶改造方面抗体酶和核酸类酶改造方面n有机介质酶催化反应有机介质酶催化反应一、酶化学修饰的应用一、酶化学修饰的应用二、酶蛋白化学修饰的局限性二、酶蛋白化学修饰的局限性1. 某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是是相对的，相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。化学修饰剂。2. 化学修饰后酶的化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变构象或多或少都有一些改变，因，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3. 酶的化学修饰只能在酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基具有极性的氨基酸残基侧链侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。性氨基酸残基在酶