酶工程-第四章

1、第四章 酶的分离与纯化第一节第一节 酶制剂的制备过程酶制剂的制备过程第二节第二节 酶的分离与提取酶的分离与提取第三节第三节 酶的纯化与精制酶的纯化与精制商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需酶的技术过程。得所需酶的技术过程。u酶的提取酶的提取与分离纯化方法较多，在实际应用与分离纯化方法较多，在实际应用中，经常进行联合使用具有较好的效果。中，经常进行联合使用具有较好的效果。商

2、洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化酶的提取与分离纯化技术路线酶的提取与分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化第一节 酶制剂的制备过程u作为一个完整的酶制备方案，应包括：作为一个完整的

3、酶制备方案，应包括：u酶活力测定方案的建立，材料的选择，预处酶活力测定方案的建立，材料的选择，预处理、对酶的性质的初步探索，制定酶的纯化理、对酶的性质的初步探索，制定酶的纯化程序及酶成品的保存。程序及酶成品的保存。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化选择条件选择条件酶的产量高酶的产量高容易培养和管理容易培养和管理产酶稳定性好产酶稳定性好利于酶的分离纯化利于酶的分离纯化安全可靠，无毒性安全可靠，无毒性u一、材料的选择一、材料的选择u虽然所有的生物体细胞在一定条件下都能合成多种虽然所有的生物体细胞在一定条件下都能合成多种多样的酶，但

4、是在酶的生产中使用的细胞必须根据多样的酶，但是在酶的生产中使用的细胞必须根据需要进行严格的选择与培育。须具备以下条件：需要进行严格的选择与培育。须具备以下条件：商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u二、材料预处理二、材料预处理u为了获得胞内酶，首先要进行细胞破碎，使为了获得胞内酶，首先要进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取和细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取和纯化。纯化。u对于不同的生物体，或同一生物体的不同组对于不同的生物体，或同一生物体的不同组织的细胞，由于细胞外层结构（壁、膜）不织的细胞，由于细胞外层结构

5、（壁、膜）不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同，必须根据具体情况进行选择。同，必须根据具体情况进行选择。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞许多酶存在于细胞内。为了提取这些内。为了提取这些胞内酶，首先需要胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处对细胞进行破碎处理。理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I

6、型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、

7、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u三、初步探索酶的性质三、初步探索酶的性质u四、制定酶的分离程序四、制定酶的分离程序u五、酶的纯度检验五、酶的纯度检验商洛学院商洛学院

8、 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化第二节 酶的分离与提取u一、酶的提取一、酶的提取u是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。称为酶的抽提。u酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中

9、，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u酶都能溶解于水，通常可酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。u提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高

10、酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。子的扩散速度，从而增大提取效果。 u为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、提取过程中还要注意控制好温度、pHpH值等提取值等提取条件。条件。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化1 1、酶的主要提取方法、酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的盐溶液的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较

11、大的酶度较大的酶酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓

12、度的升高而增加，这称解度随盐浓度的升高而增加，这称为为盐溶现象盐溶现象。 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u2、影响酶提取的因素、影响酶提取的因素u温度温度u温度对酶的提取效果有明显影响。温度高，有利于温度对酶的提取效果有明显影响。温度高，有利于提高酶的溶解度，或增大酶分子的扩散速度；温度提高酶的溶解度，或增大酶分子的扩散速度；温度过高则易使酶变性失活。使用有机溶剂提取时温度过高则易使酶变性失活。使用有机溶剂提取时温度控制在控制在010。upHu为提高酶的溶解度，为提高酶的溶解度，pH应避开酶的等电点。应避开酶的等电点。u提

13、取液的体积提取液的体积u增加提取液的用量，可提高酶的提取率。增加提取液的用量，可提高酶的提取率。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u二、沉淀分离二、沉淀分离u沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的酶的溶解度降低溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。质分离的技术过程。u根据溶解度的不同，根据溶解度的不同，使溶液中的溶质由液相转变为使溶液中的溶质由液相转变为固相析出。固相析出。u古老、实用、简单的初步分离方法古老、实用、简单的初

14、步分离方法商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化分离方法分离方法分离原理分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的解

15、质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pHpH值，使酶值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离质分离复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的

16、某些杂质变性沉淀，而不影选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离响所需的酶，从而使酶与杂质分离沉淀分离的方法沉淀分离的方法商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u盐析沉淀法（改变离子强度）盐析沉淀法（改变离子强度）u1、基本原理（盐溶和盐析）基本原理（盐溶和盐析）u向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：现象：u1) 盐溶：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。盐溶：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。u2) 盐析：高浓度的中性盐降低蛋白质的

17、溶解度。盐析：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。u高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。u不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。称分段盐析。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化在盐浓度达到在盐浓度达到某一界限后，某一界限后，酶的溶解度随酶的溶解度随盐浓度升高而盐

18、浓度升高而降低，这称为降低，这称为盐析现象盐析现象。 在一定的温度和在一定的温度和pHpH值条件下（值条件下（为常数），通过改变离子强度为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为使不同的酶或蛋白质分离的方法称为KsKs分段盐析分段盐析；而在一定的；而在一定的盐和离子强度的条件下（盐和离子强度的条件下（KsKsI I为常数），通过改变温度和为常数），通过改变温度和pHpH值，值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析分段盐析。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u在蛋白质的盐析

19、中，通常采用的中性盐有硫酸在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中钠等。其中以硫酸铵最为常用以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。用其它中性盐进行盐析。u在盐析时

20、，溶液中硫酸铵的浓度通常以在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度饱和度表示。表示。 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u有机溶剂沉淀（降低介电常数）有机溶剂沉淀（降低介电常数）u利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。之分离的方法。u1、沉淀机理沉淀机理u降低溶液的介电常数，部分引起蛋白质脱水。降低溶液的介电常数，部分引起蛋白质脱水。u溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有力增大，

21、互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。淀析出。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，例如，20时水的介电常数为时水的介电常数为80，而，而82乙醇乙醇水溶液的介电常数为水溶液的介电常数为40。商洛学院商

22、洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u2、常用有机溶剂常用有机溶剂u常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等丙醇、甲醇等 。u丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左倍左右，终浓度为右，终浓度为70%。 u3 3、优缺点：优缺点：u优点：分辨率比盐析法高；沉淀不需脱盐；溶剂易优点：分辨率比盐析法高；沉淀不需脱盐；溶剂易蒸发，沉淀易离心蒸发，沉淀易离心u缺点：容易引起蛋白质变性失活；有机溶剂易燃、缺点：容易引起蛋白质变性失活；有机溶剂易燃、易爆

23、，对安全要求较高。易爆，对安全要求较高。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u 等电点沉淀等电点沉淀(isoelectric precipitation) u1、原理原理u蛋白质在等电点时溶解度最低；蛋白质在等电点时溶解度最低；u不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 。u2、使用方法使用方法u单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等用（如盐析法、有机溶

24、剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。电点时仍有一定的溶解度。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u3、 优点：优点：u大多数蛋白质的大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内；都在偏酸性范围内；u无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低；无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低；u无需除掉多余酸即可进行下一步纯化。无需除掉多余酸即可进行下一步纯化。u4、缺点：缺点：u酸化时，容易引起蛋白质失活。酸化时，容易引起蛋白质失活。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u有机聚合物沉

25、淀法有机聚合物沉淀法 u1 1、作用机理：作用机理：u与有机溶剂类似与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。，是发展较快的一种新方法。u2 2、沉淀剂：沉淀剂：u常用分子量为常用分子量为600060002000020000聚乙二醇聚乙二醇 （PEGPEG）。）。u3 3、优点：优点：u操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。u沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEGPEG即可沉淀相当多的即可沉淀相当多的生物大分子。生物大分子。u沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第

26、四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法u选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 u1、热变性热变性u几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。u 2、pH变性变性u等电点沉淀法是等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。变性法中的一种变体。u3、有机溶剂变性有机溶剂变性u对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀

27、。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u三、离心分离三、离心分离u离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。术过程。u在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的的颗粒大小、密度和特性的不同颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。的离心机、离心方法和离心条件。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯

28、化酶的分离与纯化离心机的种类离心机的种类按离心机转速的不同，分为：按离心机转速的不同，分为： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化名称名称 转速转速(r/min)(r/min) 注意事项注意事项 低速离心机低速离心机 6000 6000 常温，注意样品热变性和常温，注意样品热变性和离心管平衡离心管平衡 高速离心机高速离心机 60006000 2500025000冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 2500025000冷冻真

29、空系统（减少空冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），气阻力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 离心机的种类 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u常速离心机又称为低速离心机，常速离心机又称为低速离心机，其最大转速在其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（以内，相对离心力（RCF）在）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。结晶等较大颗粒的分离

30、。u高速离心机高速离心机最大转速为（最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性温度升高而造成酶的变性失活失活，有些高速离心机装设有冷冻装置有些高速离心机装设有冷冻装置，称为高速称为高速冷冻离心机。冷冻离心机。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u超速离心机超速离心机的最大转速达的最大转速达 (2.512

31、)104 r/min，相对离心力可以高达，相对离心力可以高达 5105 g甚至甚至更高。超速离心主要用于更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。分子质量的测定等。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化l温度类型：温度类型：常温及冷常温及冷冻冻l超速离心机均为冷冻超速离心机均为冷冻型。型。l使用冷冻离心机时提使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。前降温，预冷离心

32、头。l使用超速离心机时先使用超速离心机时先抽真空。抽真空。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化l角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式及外摆式：外摆式一般为低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化l角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。稳、盖、旋紧。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化商洛学

33、院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化l材质：玻璃，材质：玻璃，塑料塑料l强度：和离心强度：和离心速度相配速度相配l大小：和转子大小：和转子配套配套l高速超速管要高速超速管要加盖加盖商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化l平衡、定温、定速、定时。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化常用离心方法常用离心方法 差

34、速离心法差速离心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度离心密度梯度离心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度离心等密度梯度离心商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u1、差速离心、差速离心 （differential centrifugation） u采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。的颗粒分批分离的方法。u特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 u优点：操作简单优点：操作简单 。u缺点：缺点：u分离效果较差，不能一次得到

35、纯颗粒。分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。u壁效应严重。壁效应严重。u沉降的颗粒受到挤压。沉降的颗粒受到挤压。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化差速离心分离示意图差速离心分离示意图 （a a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b b）（）（e e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u2 2、密度梯度离心密度梯度离心 u（density gradient centrifugationdensity gr

36、adient centrifugation）u样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。方法。u常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液u特点：区带内的液相介质密度小于样品物质特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。颗粒的密度。u适宜分离密度相近而大小不同的固相物质适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图 （a）离心前

37、（b）离心后 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u3、等密度梯度离心等密度梯度离心u根据颗粒的密度不同而进行分离。或称沉降平衡离根据颗粒的密度不同而进行分离。或称沉降平衡离心心 。（sedimentation equilibrium centrifugation）u离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与

38、其相的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。同的密度时不再移动，形成区带。u常用氯化铯（常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。）作为梯度介质。u特点：介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的特点：介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。密度。u适用于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。适用于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化等密度梯度离心示意图 （a）离心前； （b）离心后 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与

39、纯化酶的分离与纯化密度梯度离心密度梯度离心等密度梯度离心等密度梯度离心梯度梯度介质介质通常用蔗糖通常用蔗糖最大的梯度密度最大的梯度密度 密度密度最大的沉降样品最大的沉降样品离心离心条件条件在最前的沉降物质达在最前的沉降物质达到管底前停止，短时到管底前停止，短时间，低速度间，低速度使各组分沉降到其平衡使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高的密度区，长时间，高速度速度分离分离依据依据密度相近，但沉降系密度相近，但沉降系数不同数不同沉降系数相近，但密度沉降系数相近，但密度不同不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点沉降速度离心和沉降平衡离心的特点商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工

40、程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u小结：小结：u等密度梯度离心等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。之包括待分离物的密度范围。u差速离心差速离心是一种动力学方法，关键在于选择是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。适合于各分离物的离心力。u密度梯度离心密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。键在于制备优质的密度梯度溶液。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四

41、章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u四、过滤与膜分离四、过滤与膜分离u过滤是借助于过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。状的物质分离的技术过程。u过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。等，可以根据需要选用。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化过过滤滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为 过滤介质过滤介质 膜过滤：

42、采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2m 2m酵母、霉菌、动物细酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形胞、植物细胞、固形物等物等 滤纸、滤布、滤纸、滤布、 纤维多孔陶瓷、纤维多孔陶瓷、烧结金属等烧结金属等微滤微滤0.20.22m2m细菌、灰尘等细菌、灰尘等微滤膜、微滤

43、膜、微孔陶瓷微孔陶瓷超滤超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超滤膜超滤膜反渗反渗透透 20 20生物小分子、盐、离生物小分子、盐、离子子反渗透膜反渗透膜商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u非膜过滤非膜过滤u包括粗滤和部分微滤两类。包括粗滤和部分微滤两类。u1、粗滤粗滤u为加快过滤速度，提高分离效果，常添加助滤剂。为加快过滤速度，提高分离效果，常添加助滤剂。常用的助滤剂有：硅藻土、活性碳、纸粕等。常用的助滤剂有：硅藻土、活性碳、纸粕等。u根据推动力的产生条件不同分为：根据推动力的产生条件不同分为：常压

44、过滤常压过滤加压过滤加压过滤减压过滤减压过滤非膜过滤非膜过滤商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u2、微滤微滤u又称微孔过滤。又称微孔过滤。u广泛应用于无菌水、广泛应用于无菌水、矿泉水、汽水等软饮矿泉水、汽水等软饮料的的生产。料的的生产。u一般采用微滤膜、烧一般采用微滤膜、烧结金属等作为过滤介结金属等作为过滤介质，也可采用微滤膜。质，也可采用微滤膜。各种钛过滤器滤芯钛过滤器及不锈钢外壳商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u膜分离技术膜分离技术u借助于一定孔径的高分

45、子薄膜，将不同大小、不同借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。称为膜分离技术。u膜分离所使用的薄膜主要由膜分离所使用的薄膜主要由丙烯腈丙烯腈、醋酸纤维素醋酸纤维素、赛璐玢赛璐玢以及以及尼龙尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。有时也可以采用动物膜等。u膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔

46、径有多种规格可供使用时选择。截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理的推动力的不根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理的推动力的不同，膜分离可分为三大类：同，膜分离可分为三大类： 膜分离膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤微滤超滤超滤反渗透反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u1、加压膜分离加压膜分离

47、u根据所截留物质颗粒大小的不同，分为根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：方法截留颗粒截留颗粒直径直径操作压力操作压力应用应用微滤微滤0.22 m 0.1MPa除菌除菌超滤超滤20A 0.2 m0.10.7MPa分离病毒及分离病毒及生物大分子生物大分子反渗透反渗透20 (40,000) 压力差，100kPa 筛分超滤UF 120 (10,000-40,000)压力差，100kPa 筛分纳滤NF 1 (1001000)压力差，100) 压力差，1000kPa 优先吸附、溶解扩散 四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离技术的基本特征 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第

48、四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化四种常用膜分离过程的截留特性四种常用膜分离过程的截留特性本节目录商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u五、层析分离五、层析分离u层析分离技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离层析分离技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。方法。u它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的为固定的( (称为固定相称为固定相) )，另一个相则流过此固定相，另一个相则流过

49、此固定相( (称为流动相称为流动相) )并使各组分以不同速度移动，从而达并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。到分离的目的。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u层析法的分类：层析法的分类：u流动相：两种状态。流动相：两种状态。u液体作为流动相；液体作为流动相；气体作为流动相。气体作为流动相。u固定相：两种状态。固定相：两种状态。u固体吸附剂作为固定相；固体吸附剂作为固定相；u以吸附在固体上的液体作为固定相。以吸附在固体上的液体作为固定相。u按两相所处的状态分类：按两相所处的状态分类：液相层析液相层析 气相层析气相层析液

50、液- -固层析固层析液液- -液层析液层析气气- -固层析固层析气气- -液层析液层析商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u按层析过程的机理分类：按层析过程的机理分类：u吸附层析吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。差异。u分配层析分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。分配系数的不同。u离子交换层析离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。的不同。u凝胶层析凝胶层析：利用某些凝胶对于

51、不同分子大小的组分：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。阻滞作用的不同。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：u柱层析柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。方向移动而达到分离。u纸层析纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。流动相展开，以达到分离鉴定的目的。u薄层层析薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的

52、分离和鉴定以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定的方法。的方法。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化层析分离方法层析分离方法层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离分离离子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目

53、的种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离性结合在一起，实现组分分离商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的

54、分离与纯化酶的分离与纯化u吸附层析吸附层析u吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。不同而使混合物中各组分分离的方法。u吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。设备简单。u吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附柱中，装置成吸附层析柱吸附层析柱。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化

55、u层析时，欲分离的混合溶层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。再加入洗脱剂解吸洗脱。u洗脱时，层析柱内不断发洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。再吸附的过程。u溶剂洗脱法溶剂洗脱法u置换洗脱法置换洗脱法u前缘洗脱法前缘洗脱法 商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u分配层析分配层析u分配层析是利用各组分在两相中的分配系数分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。不同，而使

56、各组分分离的方法。u分配系数分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中浓度的比值。浓度的比值。u在层析条件确定后，层析系数是一常数。在层析条件确定后，层析系数是一常数。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固固定相定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持，这种

57、溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。物上。u另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动，称为流动相。流动相。u当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。两相之间进行连续的动态分配。u常见的有：纸上层析、分配薄层层析、分配气相层常见的有：纸上层析、分配薄层层析、分配气相层析。析。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u离子交换层析离子交换层析u是利用离子交换剂上的是利用离子交换剂上的可解离基团（活

58、性基团）对可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析目的的一种层析分离方法。分离方法。u离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。可解离基团（活性基团）而制成。u按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离阳离子交换剂子交换剂和和阴离子交换剂阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换

59、剂质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。进行酶的分离纯化。商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化离子交换剂-带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载体Diethylaminoethyl(DEAE) 阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质) 阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章

60、酶的分离与纯化酶的分离与纯化u离子交换剂的选择离子交换剂的选择ua. 强、弱离子交换剂的选择：强、弱离子交换剂的选择：u强型：适用的强型：适用的pH范围广，制备无离子水范围广，制备无离子水 u弱型：适用的弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质范围窄，分离生物大分子物质 ub. 阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性u若若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂商洛学院商洛学院 生物医药工程系生物医药工程系酶工程酶工程 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化u凝胶层析凝胶层析u又称为凝胶过滤，分子又称为凝胶过滤，分子排阻层