转基因工程在小麦上的应用

1、湖南农业大学课程论文学 院： 农学院 班 级：种子科学与工程（1）班姓 名： 董帅厅 学 号：201241531108课程论文题目：转基因工程在小麦上的应用综述课程名称：种子学评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期： 年 月 日转基因工程在小麦上的应用综述摘要：小麦是世界上主要的粮食作物，自1992年第一株转基因小麦诞生以来，小麦转基因技术发展较快，为开展小麦分子育种奠定了基础。目前，研究涉及抗病、抗虫、抗逆、品质改良、提高产量等方面，其中研究较多的为抗病(39.7%)和品质改良(25.6%)，部分转基因小麦品系已进行环境释放及生产性试验 1 。 关键词： 小麦 幼胚培养 转基因1 小麦幼

2、胚组织培养品种及幼胚胚龄的选择1.1 小麦幼胚组织培养品种选择 自1978年Shimada成功地通过小麦幼胚培养获得再生植株以来，幼胚被认为是小麦组织培养最有效、最理想的外植体来源之一。Xia等在用根癌农杆菌介导小麦胚性愈伤组织时发现，成功的基因转化依赖于适宜基因型的选择，并且小麦幼胚培养效率与小麦品种、栽培地区有关。故大多数研究者都是从本地出发，以本地选育的小麦品种、品系以及农家品种为测试对象，考察幼胚脱分化和再生植株特性。这些品种主要集中在安徽、河北、河南、陕西、江苏、山东、四 川、黑龙江、湖北、山西、北京等主要小麦种植区域2。1.2 小麦幼胚组织培养幼胚胚龄的选择胚龄对幼胚组织培养的影响

3、。不同胚龄对小麦幼胚组织培养的作用效果明显不同, 其结果记录于表 1。 由表 1 可知, 幼胚在 10 20 d 胚龄时均能较好地形成愈伤组织,其出愈率皆在 90. 00%以上;其中, 12 d 、14 d、16 d 胚 龄时形成愈伤组织块最多,其出愈率分别为 95. 00%、95. 00%、 96. 67%;幼胚在 14 d 和 16 d 胚龄时胚性愈伤组织形成显著地 高于其他胚龄,其胚性诱导率分别为 54. 39%、60. 34%。因此, 胚龄对幼胚组织培养出愈率影响不大,适宜范围为 12 16d; 胚性愈伤组织诱导的适宜胚龄为 14 16 d;综合考虑胚龄对出愈率和胚性愈伤组织诱导率的作

4、用, 幼胚组织培养适宜的胚龄为 14 16d3 。在小麦幼胚培养中，衡量小麦最适胚龄的标准因研究方向和思维各异。目前主要通过长度，直径，授粉后发育时间，种子形态指标等来进行判断2。 1.3 小麦幼胚组织培养幼胚基因型的选择 在小麦幼胚培养中不同的基因型在致密愈伤组织的诱导频率、分化频率及分化能力的保持方面存在一定的差异。在地域性上美国冬小麦出愈率高于中国半冬性小麦，在无性系株系与常规材料之间，前者高于后者，在历代杂交种与双亲间的出愈关系上不同组合中出现较大差异,并且存在明显的剂量性4 。与之相反，蔡体树等对F0和F1代未成熟胚进行诱导培养，其愈伤组织的分化能力都没有表现出杂种优势，无论是接种的

5、外植体本身处于杂合状态，还是供体植株处于杂合状态，愈伤组织的分化能力都不存在杂种优势现象。品种之间对离体培养条件的反应不同，究竟受不受遗传特性的影响，人们对小麦组织培养力（Tissue couture Respone，TCR）进行染色体水平和基因水平的 研究表明，小麦幼胚培养力是受少数基因控制的质量性状，同时也存在一些修饰基因，许多控制幼胚培养力的基因位于染色体B上，且第2、 4、 6部分同源染色体群对幼胚培养力的影响较大。小麦幼胚培养力也与细 胞质因子有关，特定的核质组合与培养条件的互作与幼胚培养力有密切的关系5。2 小麦转基因方法 2.1 PEG法与电激法 在小麦遗传转化研究早期阶段，转化

6、多以原生质体为受体进行，依赖于小麦原生质体的植株再生。原生质体再生植株最早是在20世纪70年代在烟草中获得的，后来这项技术逐渐扩展应用于禾谷类作物。聚乙二醇诱导的小麦原生质体遗传转化，是通过多聚分子PEG在二价阳离子的作用下与裸露的DNA 形成共沉淀，诱导外源DNA进入原生质体，进行遗传转化。郭光沁等用分别带有 G U S 和 H P T 的pBI221 及pBI222作为载体，转化小麦品种济南177的原生质体，筛选得到抗性体细胞胚和小块愈伤组织，进而获得转基因植株，转化频率达2×10-53×10-5。 电激介导的小麦原生质体遗传转化，是由PEG直接导入法发展而来的。电激介

7、导转化借助高强度电脉冲作用，使原生体质膜产生瞬时可逆穿孔，导致DNA分子穿过小孔进入原生质体。梁辉等用改良的环形电极，将 B a r 和 G U S 导入完整的小麦幼胚组织中，经 PCR和Southern杂交分析，外源基因已稳定整合到小麦基因组中，转化频率达7.5%。虽然已经用原生质体转化获得了小麦转基因植 株，但该法在小麦中的应用至今还不够理想。原因是 此方法需要以原生质体培养为基础，而小麦原生质体的分离和培养难度大、周期长，培养过程中体细胞突变率高，再生植株能力低，即使获得再生植株，也往往不育。且获得的转基因植株普遍存在着结实率低，外源DNA拷贝数高、片段化、基因重排以及基因表达沉默等问题

8、6 。 2.2 离子束介导法 离子束介导转化是在低能离子束注入植物组织后，对植物细胞产生刻蚀，受刻蚀后的细胞壁产生局部穿孔，细胞膜透性发生变化，从而可为外源DNA进入细胞提供多个可自动修复的微通道。另外，带正电的离子在微通道内积累，有助于带负电的外源DNA进入细胞。同时，离子注入对靶细胞DNA造成一定损伤，由损伤诱导的修复作用可为外源DNA在受体基因 组上的整合和重组提供便利条件。2.3 花粉管通道法 花粉管通道法是80年代初期根据植物远缘杂交理论提出的外源基因导入方法, 即利用植物授粉后在子房中形成的花粉管(花粉引导组织), 外源质粒DNA经花粉管和珠心进入胚囊, 进一步进入受精卵, 由于刚

9、刚完成受精的卵细胞还处于类似原生质体状态, 尚未形成细胞壁, 正在活跃的进行 DNA 复制和细胞分裂, 可以将外源DNA片段整合到受体基因组中。Langridge 等尝试了花粉管通道法, 但没 有获得转基因植株。曾君祉等利用花粉管通道法 将 nptII 基因导入了小麦, 获得了小麦转基因植株。成卓敏等利用花粉管通道法将大麦黄矮病毒 CP 基因导入了小麦, 培育了抗黄矮病转基因小麦新材料。后 来, 我国学者对花粉管通道法在小麦中的应用进行了 更多探索和应用7 。2.4 基因枪法 基因枪轰击是将外源基因在Ca2+或亚精胺等作用下吸附在重金属金或钨粒子表面（直径1 mm左右）制成DNA微弹，用基因枪

10、将微弹高速射入植物受体细胞，释放出的DNA分子随机整合到植物基因组中，从而实现遗传转化。自Vasil等在世界上首次报道利用基因枪转化技术获得小麦转基因植株至今，由基因枪介导的小麦遗传转化作为改良小麦性状、提高小麦抗性的主要手段之一被广为应用。王小军等用基因枪将含有 CaMV35S启动子的 B x n 基因和 N P T I I 基因导入小麦幼胚后，以抗性鉴定和Southern杂交分析证明，获得的 是转基因植株，转化频率为1.9%。在随后的几年中，人们又相继以小麦的幼胚、幼穗、盾片以及来源于它们的胚性愈伤组织等为靶组织，用基因枪将具有抗逆、抗病、抗虫、抗除草剂、优质 8 等性状的目的基因导入小麦

11、，由此小麦基因工程研究进入了一个新的阶段。 2.5 农杆菌介导法 在植物基因工程的发展中，研究和应用比较清楚和成功的是根癌农杆菌( A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s )介导的遗传转化。根癌农杆菌携带的Ti质粒上含有一段可以转入植物细胞中的T-DNA(Transfer DNA)，根癌农杆菌介导转化植物的基本原理亦即构建到T-DNA上的目标基因可随T-DNA导入植物，进而整合到受体植物的染色体上。过去人们一直认为包括小麦在内的禾谷类作物不在农杆菌的宿主范围之内，直到20世纪90年代，农杆菌转化技术才在单子叶植物上取得了突破性的进展。在小

12、麦上，Mooney等用扫描电镜观察证明了农杆菌介导转化小麦的可行性，但未能获得转基因植株。1997年，Cheng等首次报告利用根癌农杆菌介导法获得了较高频率稳定结合的小麦转基因植株并对后代进行了分析。随后，一些学者也相继报告了农杆菌介导小麦遗传转化的成功6。农杆菌介导法转化成功的受体类型主要是以幼胚、幼穗、成熟胚和花药为外植体的离体组织和以茎尖 生长点和花器官为受体的整株水平转化。由于幼胚 具有高的再生率，目前报道的大多数农杆菌介导的小麦转化以幼胚为受体材料4，但是由于这些离体组织 依赖于组织培养和植株再生途径，操作复杂、耗时、成本高、转化效率低、容易产生体细胞变异和高的基因型依赖，并且易发生

13、农杆菌的二次污染，对操作和培养条 件要求也极其严格。因此，不依赖于组织培养的小麦整株水平转化近年来吸引了人们的更大兴趣。 3 展望利用基因工程方法育种有其独特的优势，不仅基因来源广泛而且能够实现对特定性状精确高效的改良，有着广阔的应用前景。在小麦转基因育种方面，虽然已成功获得一批转基因小麦植株，但与其他作物相比，通过转基因方法育种仍存在较大差距。完善的小麦转基因技术体系尚未建立，小麦遗传转化技术还不能作为一项常规技术普遍应用。目前在小麦转基因技术上主要还是依赖基因枪法，农杆菌介导法相对于基因枪法成本较低，但利用离体组织受体的方法依然较为费时、费力，而且对当前生产上主栽品种某一性状的改良，往往经

14、过组织培养和再生阶段后其生产力明显 下降。利用小麦幼穗活体水平上的农杆菌介导法具有其他方法所不可比拟的优势，成本低、操作简便，转化 效率高，而且当代可获得转基因的种子，T2代可获得纯合的转基因株系，无需组培再生阶段，对于保持主栽品 种的生产力而改善其某一性状具有特殊的优势，有望发展为小麦转基因的常规技术，在提高小麦的品质性状和抗逆性能等方面的品种改良中发挥重要作用9。1 小麦转基因技术研究及其应用_喻修道2 小麦幼胚组织培养研究进展_左静静3 胚龄和激素对小麦幼胚组织培养的影响_赵占军.4 梁竹青,高明尉.不同小麦基因型对体细胞组织培养的反应J.Z中国农业科学,1986,(2):42-48.5 徐星明,于飞.小麦幼胚组织培养力的遗传研究J.遗传,1991,13 (6):34-37.。6 小麦转基因技术及转化功能基因研究进展_王维7 小麦转基因方法及其评述_叶兴国8 Chen