固定化胰蛋白酶到多功能中间大孔核壳微球一个新的快速酶催化平台创新

1、胰蛋白酶固定到多功能介孔核壳微球：快速酶催化的新平台摘 要本研究通过将胰蛋白酶固定在多孔核壳Fe3O4 fTiO2微球上形成了一种简单、快速、有效和可重复使用的微波辅助胰蛋白酶消化系统。这种磁芯和二氧化钛壳纳米结构具有多种孔径（2.4和15 nm），高的孔隙体积（0.25cm3 g1）和大的比表面积（50.45 m2 g1）。该系统可以实现蛋白质的快速、高效微波辅助胰蛋白酶消化。各种标准蛋白质（细胞色素C（Cyt-c），肌红蛋白（MYO），-乳球蛋白（-LG）和牛血清白蛋白（BSA）可以在微波辐射条件下45s内被消化，并能通过质谱（MS）有效地鉴定分析；即使底物浓度低至5 ng L-1也可以测

2、定。此外，45s微波辅助胰蛋白酶消化系统在胰蛋白酶固定化微球重复使用5次后仍然有效。重要的是，来自10 g小鼠脑蛋白的1715个特异蛋白质在经过45s微波辅助胰蛋白酶消化处理后，能够精确地鉴定。关键词：介孔；磁铁矿；二氧化钛；胰蛋白酶；消化；质谱法一 引言蛋白质组学可以提供蛋白质表达变化的全面认识，从而对生物体的结构、功能和调控进行细节描述。因为蛋白质组学侧重于研究从高度复杂的生物样品中提取出来的蛋白质，以此获得蛋白表达变化的全面认识,这有助于促进个性化治疗1-3。酶作为天然催化剂，在所得肽的质谱检测用于蛋白质的鉴定和翻译后修饰的调查之前，广泛应用于蛋白水解消化中4-6。酶解是蛋白质组学中必要

3、和关键一步，并且溶液和凝胶中蛋白质的水解是常用的蛋白质水解方法7,8。然而，通常由于劳动强度大，样品损失，酶的低稳定性，难回收，消化时间过长以及低浓度蛋白质的消化有限等使得酶解的应用受到限制9-11。因此，发展一种快速有效的蛋白水解方法对于实际生物医学中大规模的蛋白质组分析非常重要。将酶固定在固体载体上，可以提高酶的稳定性和水解效率，同时也会促进产物分离和酶的回收利用12。随着纳米技术的迅速发展，各种纳米结构被开发用于载体以提高酶的稳定性和活性13-17。除了酶载体的组成，酶载体的结构在酶的固定化、酶活性和酶效率中也起着重要的作用18,19。特别是，大孔介孔材料能够作为有效的载体支载大量的酶，

4、并能转运靶标生物分子20-22。尽管有了这些丰富的研究成果，许多现有的酶载体仍然有一些缺点。例如，由于酶分子间缺乏特异的相互作用，而降低了酶的活性和酶催化效率，所以必须进行繁琐复杂的预修饰作用23。此外，固定化胰蛋白酶的再生几乎不可能实现，并且酶载体也不便于离心分离24。对于高生产量的蛋白质组学来说，加速酶消化很迫切。因此，开发新型有效的酶固定化技术对于加速和方便蛋白水解至关重要。磁性微粒具有较好的磁响应性，在水中分散性好，良好的生物相容性和化学稳定性的特点，它们已被广泛应用于各种生物分离过程中25-27。由于磁性核壳结构优良的特性和对多个离散组分之间产生的协同作用，它们吸引了大量的研究关注。

5、最近，有研究证明，磁核和二氧化钛壳微球比纯Fe3O4粒子具有更强的微波吸收性能28。微波辐射可以加速蛋白质的酶解29,30，而TiO2材料基于其路易斯酸性质显示了对生物分子的高亲和力和高吸附能力31-33。因此，具有磁核和多孔二氧化钛壳的核壳微球能够作为有效的酶固定化载体。应该指出的是，尽管在优化的试验条件下通过利用TiO2对磷酸肽的磷酸基团特殊的亲和作用，TiO2可以作为磷酸肽浓缩的有效亲和材料（例如，低pH下的三氟乙酸控（2-3），通过其羧基的质子化防止非磷酸化肽的非特异性结合；50-80%乙腈用于阻止与吸附剂的疏水相互作用），但是，非特异性的结合仍然无法避免。这表明，TiO2在一个合适的

6、pH值条件下（例如，弱碱性），可以对非磷酸化的生物大分子（如蛋白质、酶和肽）的羧基产生相对较强的螯合作用和其他的相互作用（如氢键相互作用）。更重要的是，TiO2对生物分子的亲和性可以通过使用不同的实验条件（例如，溶剂和pH值）来调节。因此，可以推断，通过利用合适的溶剂条件（例如，一个适当基本反应溶液）下，TiO2可以与靶标生物分子的羧基产生螯合作用，从而将蛋白质、酶和肽吸附。在此，我们首次报告：将胰蛋白酶固定到花状核壳磁性微球（这些微球有介孔/大孔二氧化钛壳（记为Fe3O4 fTiO2），是一种新型快速的微波辅助胰蛋白酶消化平台（方案1）。方案1. 示意图(a)作为纳米反应器的固定化胰蛋白酶F

7、e3O4 fTiO2微球的制备；（b）微波辅助胰蛋白酶消化系统通过将TiO2壳的多孔性和特异性亲和力与Fe3O4的磁性和微波吸收性能结合，该新型的胰蛋白酶消化平台具有以下几个特性：（1）二氧化钛壳具有亲和力和高的比表面积，能够保证对胰蛋白酶的高亲和力和高承载能力；（2）介孔/大孔壳结构允许酶和靶标蛋白质的进入，也会促进反应物和酶解产物自多孔结构扩散；（3）在典型的胰蛋白酶消化和快速磁分离条件下保持坚固的结构，能够帮助它们再生利用。二 材料与方法2.1 材料三氯化铁（FeCl36H2O），乙二醇（EG），异丙醇（IPA），二甲基甲酰胺（DMF）和氢氧化铵（NH3H2O）购自北京化学试剂有限公司。

8、钛酸四丁酯（TBOT），乙腈（ACN），碳酸氢铵（NH4HCO3），芥子酸（SA），2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dhb）和二硫苏糖醇（DTT）均购自阿拉丁（上海，中国）。肌红蛋白（取自马心），细胞色素C（Cty-c），-乳球蛋白（-LG），牛血清白蛋白（BSA）和胰蛋白酶（取自牛胰腺，TPCK处理）购自西格玛-奥德里奇（St.路易斯，MO，USA）。碘乙酰胺（IAA）由阿法埃莎（美国）提供。细胞裂解缓冲器是从Merck-Novagen（达姆施塔特，德国）购买。所有的化学剂无需进一步纯化即可使用。2.2 微波辅助胰蛋白酶消化系统2.2.1制备Fe3O4 fTiO2核壳结构的微球根据我们先前报道

9、的合成工艺27,35 制备磁性Fe3O4粒子，并通过一个简单的溶剂热法合成花状Fe3O4 fTiO2分层微球。通常情况下，合成的Fe3O4颗粒（40 mg）超声时可以充分分散于DMF（10mL）和IPA（30mL）中。然后，添加钛酸四丁酯（2mL）到上述分散体系，并超声5 min。将混合物转移到一个聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜（50mL），200加热10小时。最后，产品用乙醇冲洗，60干燥过夜，并在400下煅烧2小时以除去残余的有机物质。2.2.2构建微波辅助胰蛋白酶消化系统胰蛋白酶（2mg）分散在碳酸氢铵缓冲液（2mL，25mM碳酸氢铵水溶液，pH 7.8）中形成均匀的悬浮液。然后，添加Fe3

10、O4 fTiO2微球（4mg）到悬浮液进行混合，4振摇30分钟，达到最大吸附。随后，借助磁铁分离和收集吸附胰蛋白酶的微球，以去除多余的胰蛋白酶，再用碳酸氢铵缓冲液洗涤微球三次，除去表面或弱结合胰蛋白酶。用紫外-可见分光光度计在280nm下进行检测，通过比较固定化前后的胰蛋白酶溶液浓度测定固定化胰蛋白酶的量。将获得的微球再分散到200L碳酸氢铵缓冲液，通过振荡形成均匀的悬浮液。2.3 利用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球进行蛋白质的微波辅助 胰蛋白酶消化2.3.1标准蛋白质的微波辅助胰蛋白酶消化通过利用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球，来评价细胞色素C（Cyt-c），肌红蛋白（M

11、YO），-乳球蛋白（-LG）和牛血清白蛋白（BSA）四种标准蛋白的微波辅助酶解效率。首先将上述蛋白质溶解在碳酸氢铵缓冲液中形成不同浓度的蛋白溶液。在0.5mL离心管中，加入5L固定化胰蛋白酶的 Fe3O4 fTiO2微球混悬液，再加入50L蛋白质溶液，并振摇1分钟。随后，离心管放在输出功率为800 W的微波炉中进行微波照射，过程中保持离心管的盖子打开。几秒钟的微波照射后，从微波炉中取出离心管。借助外部磁铁，将上清液分离收集以备下一步检测。分离得到的固定化胰蛋白酶的 Fe3O4 fTiO2微球，用碳酸氢铵缓冲液冲洗两次回收。作为对照，游离胰蛋白酶也要在溶液中进行酶解。在溶液中进行酶解，按酶/底物

12、质量1:50，将胰蛋白酶加入蛋白质溶液中，并在37保温12小时。2.3.2 鼠脑蛋白质的微波辅助胰蛋白酶消化 小鼠处死后，及时清除其大脑并在冰冷的溶菌缓冲液中放置30 min，随后超声提取混合物中的蛋白。上述结果混合物在4条件下，离心（12000 r）1 h以清除细胞碎片。收集上清液，蛋白浓度用Bradford法测定。提取的蛋白经超滤（10 kD）纯化和离心分离。将蛋白质用10mM DTT还原30min并于暗处用50mM IAA烷基化30min后，重新悬浮在8 M尿素溶液。得到的鼠脑蛋白使用50mM碳酸氢铵溶液稀释到目标浓度。10g小鼠脑蛋白质与固定化胰蛋白酶的 Fe3O4 fTiO2微球混合

13、，振摇1分钟后用于45s微波辅助胰蛋白酶消化。消化过程类似于标准蛋白质。2.4 MS分析用移液管量取1L胰蛋白酶和1L基质溶液混合，基质溶液含20 mg mL-1 DHB（50%乙腈水溶液，V / V）和1%（V / V）磷酸水溶液，0.5L的混合物沉积到MALDI靶上，并由Bruker Autoflex III MALDI-TOF MS 分析。碎片离子谱研究参数被提交给MASC搜索数据库并进行相应肽的鉴定。纳米液相色谱-电喷雾质谱（纳米LC-ESI-MS）分析。一个配备了Eksigent, Dublin, CA的AB SCIEX TripleTOF 5600系统（福斯特城，CA，USA）被用

14、于纳米LC-ESI-MS测量。获得的质谱数据采用ProteinPilotTM 4.0软件处理，这一软件有Paragon搜索模式。蛋白质描述性试验统计模板（PDST）3.0（AB SCIEX）被用于多重结果的取向和错误发现率的评价（FDR）。2.5 表征由配备了能量色散X射线光谱（EDX，JEOLJXA-840）的场发射扫描电子显微镜（FESEM，S4800，Hitachi）获得（SEM）图像。在200 kV条件下，采用一个FEI Tecnai G2 S-Twin透射电子显微镜，获得（TEM）图像。在液氮温度（77 K）下用Micromeritcs ASAP 2010M装置测定氮吸附等温线，比表

15、面积由BET-埃米特-特勒（BET）法测定，总孔体积由t-plot方法计算，孔隙大小分布由提供的BJH软件包分析。在300 K，由一种超导量子干涉器件（SQUID）磁强计（量子设计MPMS XL）测量磁化强度。紫外可见吸收光谱值由岛津-UV-1750紫外可见分光光度计进行测量。三 结果与讨论3.1 Fe3O4 fTiO2微球核壳结构表征蛋白质微波辅助酶解系统的构建策略如方案1a所示，涉及三个步骤。首先，制备Fe3O4粒子，它能作为微波吸收剂和磁分离的电机 30,36 。然后，通过一个简单的溶剂热法和煅烧过程，将介孔/大孔TiO2壳层包在磁核上,TiO2壳层用于固定吸附酶。最后，将胰蛋白酶固定到

16、多孔Fe3O4 fTiO2结构，形成微波辅助蛋白质的胰蛋白酶消化系统。用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对微球的形态和结构进行了详细的描述。图S1a，b图的Fe3O4微球SEM图像显示：它们是具有良好分散性的球形颗粒，平均尺寸为450nm，由许多纳米颗粒团聚构成。通过溶剂热处理包覆TiO2壳后，得到的微球呈花状多孔表面（图S2c和d）并且直径增加（ca.1 m），这意味着形成了不均匀的壳。通过比较，煅烧后的Fe3O4 fTiO2微球没有了吸附的有机物质（图1a和b），它们仍然保留了几乎同初始微球相同的花样结构和尺寸。图1. Fe3O4 fTiO2微球的SEM（a，b）和TEM

17、（c，d）图像TEM图像（图1c和d）表明，微球具有明确的核壳结构。显然，花状的壳是由许多纳米花瓣包覆在Fe3O4核周围，形成的孔径为50-200nm的大孔结构。高分辨率透射电子显微镜图像进一步显示（图1c和d），纳米花瓣由许多小晶粒组装在一起，从而构建了多孔结构。图1d显示，可以观察到这些纳米晶体的晶格条纹，并且这些晶格条纹间距约为0.3 nm，可以索引到（101）的锐钛矿相平面。值得注意的是，介孔/大孔壳结构的Fe3O4 fTiO2微球不仅具有高的比表面面积和大量亲和位点，以确保对胰蛋白酶的高固载量，还提供蛋白质进入的大孔，反应物和酶解产物扩散的小孔。 Fe3O4 fTiO2微球的元素组成

18、和晶体结构可通过能量色散X射线（EDX）光谱和粉末X-射线衍射（XRD）进一步验证。EDX分析证实了Fe3O4 fTiO2微球Ti，Fe和O的存在（图2a）。图2. (a)EDX频谱；(b) Fe3O4fTiO2多孔微球的XRD图谱在XRD图谱中（图2b），明显的衍射峰和那些从锐钛矿TiO2（JCPDS卡片号21-1272）的Fe3O4 fTiO2峰，可以分别归属到Fe3O4（JCPDS卡片号75-0449）的特征衍射峰。这些结果进一步证实了TiO2壳层的形成。进一步通过N2吸附/解吸等温线对介孔/大孔结构进行描述。如图S2所示为Fe3O4 fTiO2微球N2吸附-脱附等温线，呈典型的IV型曲

19、线，说明Fe3O4 fTiO2微球具有多孔性结构。计算得到Fe3O4 fTiO2微球的平均布鲁诺尔-埃米特-特勒（BET）比表面积和总孔隙体积，分别为50.45m2 g-1和0.25cm3 g-1。孔隙大小分布（图S2，插图）显示了Fe3O4 fTiO2花状微球两套不同的孔尺寸，集中在2.4和15.0 nm，与透射电镜观察结果一致。图3所示为花状Fe3O4 fTiO2微球的磁滞回线，展示了其在室温下的超顺磁性。Fe3O4 fTiO2微球饱和磁化强度（MS）值为30.1 emu g-1，它可以在磁分离下30s内迅速从混合物中分离。显然，多孔结构和良好的磁响应性，使得该复合材料有助于胰蛋白酶的固载

20、和分离。图3.（a）Fe3O4 fTiO2微球的固定化酶量作为时间的函数和上清液固定化酶之前和之后的紫外吸收光谱（插图）；（b）Fe3O4 fTiO2微球，胰蛋白酶和胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的红外光谱 由V-550紫外-可见分光光度计测定Fe3O4 fTiO2微球固定化胰蛋白酶的能力。如图3a所示，由于二氧化钛壳的大孔结构能够快速吸附和亲和酶，胰蛋白酶可以在30min内达到最大吸附量，这将有助于消化蛋白质。胰蛋白酶的固载量是144.6g mg-1（酶/载体）。图3b所示为胰蛋白酶和Fe3O4 fTiO2微球固定化胰蛋白酶前后的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。在FTIR光谱中，特

21、征吸收峰约在560cm1和460cm1的分别是Fe3O4的Fe-O键、TiO2壳Ti-O键的伸缩振动。然而，胰蛋白酶在1000-1800cm1和2750-3000cm1范围内的许多新的特征吸收峰，可以在胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球红外光谱上观察到。以上结果表明，胰蛋白酶分子已成功地固定在Fe3O4 fTiO2微球的壳孔上。3.2微波辅助蛋白质的胰蛋白酶消化方案1b所示是利用Fe3O4 fTiO2微球的微波辅助胰蛋白酶消化蛋白质的过程，就是将目标蛋白溶液和胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球球混合在一起，再用微波辐射。由于胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球壳具有大孔结构，目

22、标蛋白可以快速进入其大孔隙进行消化。酶解产生的多肽也可以迅速通过孔扩散，以暴露出固定化胰蛋白酶，使其更多的于蛋白质相互作用，提高催化效率。水解完成后，借助磁铁分离收集胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球，获得的目标蛋白用于质谱检测。3.2.1标准蛋白质消化肌红蛋白，称为抗胰蛋白酶消化蛋白 37 ，作为模型蛋白，用于评价微波辅助胰蛋白酶消化系统。分别对微波辐射时间和Fe3O4 fTiO2微球的胰蛋白酶固定化量进行优化，图4a给出了肌红蛋白在不同微波消化辐照时间下，蛋白消化产生的相应肽的序列覆盖率和肽段匹配数。结果表明，有62%序列覆盖的10肽在15s微波辐照处理后可观察到，并且具有最高的序列

23、覆盖的目标肽可以在45s微波辐照处理后观测到。进一步增加微波辐照时间将导致较低数量的相应匹配肽和序列覆盖产生，这可能因为一些肽在延长微波辐射时会降解。因此，45s为最佳微波辐照时间。图4b所示为加入不同量的胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球，经微波辐射处理45s后，肌红蛋白消化产生的肽的相应的序列覆盖率和肽匹配数量。当使用100g胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球时，可以得到更好的微波辅助蛋白质消化效率。因此，微波辅助蛋白质消化的最佳实验条件是：使用100g胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球，经45s微波辐射处理，这将产生最佳肽匹配和肽序列覆盖。图4.（a）微波辐射时间对肽段

24、匹配数和肌红蛋白的序列覆盖（50ng L-1，50 L-1）的影响；（b）胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的量对肽段匹配数和肌红蛋白的序列覆盖的影响图5显示的是：利用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球，在最佳条件下消化肌红蛋白的MS图，可以检测到肌红蛋白消化产生的15个目标肽。作为对照，游离酶在溶液中的消化，也需要按酶/底物质量比为1:50（图5b）于37下反应12h。在序列覆盖为61%时只有10个目标肽能够被有效的识别。图5.（a）肌红蛋白经45s微波辅助胰蛋白酶消化的质谱；（b）在溶液中消化12 h的质谱；（c）低浓度肌红蛋白（50ng L-1，50 L-1）通过45s微波辅

25、助胰蛋白酶消化的质谱在右上角的数量是最高的峰值强度因此，45 s微波消解法消化优于溶液中酶解，溶液中酶解需要变性过程并且反应12 h。在蛋白质组学和生物医学的检验研究中,快速胰蛋白酶消化和少量蛋白质生物样品分析是很常见也很重要的一步。然而，小量蛋白质生物样品往往由于低浓度，小体积、低酶/蛋白质比例使其在溶液中的酶解受到限制。图S4所示为酶与底物质量比为1:50时，肌红蛋白（5 ng L-1，50 L）经溶液中酶解的质谱图。可以观测到少数的低强度峰，但无蛋白可以与其匹配。从上述结果可以看出，胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球对酶有高承载能力，易于分离并能有效转移蛋白质，能够进行快速的微波辅

26、助蛋白质的胰蛋白酶消化。图5c为肌红蛋白在很低的浓度（5 ng L-1，50 L）时的微波辅助酶解质谱图。根据质谱分析结果，序列覆盖率为48%的7肽可以明确地归属于肌红蛋白。以上结果表明45s微波辅助胰蛋白酶水解所得结果比利用溶液中消解法更好，突出了微波辅助胰蛋白酶消化的优势。因为具有良好的磁响应性，使用过的胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球可以用碳酸氢铵缓冲液洗涤两次后回收重新利用。如图6a所示，重新利用的胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球，在微波辅助酶消化过程中仍然高效（例如，匹配的肽数量为15，序列覆盖率为90%）。更重要的是，即使胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球重复

27、使用五次后（图6b），序列覆盖率为74%的12肽还可以被识别，这就说明胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球在微波辅助胰蛋白酶消化中具有优良的可重复利用性。使用三种其他蛋白质（Cty-c，-LG，BSA），分别做45s微波辅助胰蛋白酶消化试验（方法1）和溶液中12 h酶解试验（方法2），来探讨利用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球进行微波辅助蛋白质消化的普遍适用性。S5的MALDI质谱图显示的是这些蛋白的分解过程。通过数据搜索后，许多目标肽的肽段匹配数可以被检测到，（方法1：细胞色素C-15， - LG-17，BSA-24；方法2：细胞色素C-12，- LG-14 ，BSA-16）和高

28、序列覆盖率（方法1：细胞色素C-90%，- LG-76% ，牛血清白蛋白-29%；方法2：细胞色素C-76%，-LG-72%， BSA-20%）。上述结果进一步验证：使用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的微波辅助蛋白质消化对各种生物样品都有效，并且优于12 h溶液酶解方法。图6.重复使用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球用于肌红蛋白消化（a）重复使用第二次的质谱；（b）重复使用第五次的质谱以上结果表明，胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球可以在微波辅助条件下快速的消化蛋白质。根据以往的报告 28,30,38-40 ，有两个可能的原因可以解释这一结论：一方面，蛋白质吸附在胰蛋白

29、酶固定化Fe3O4 fTiO2微球上可以形成局部高浓度的胰蛋白酶和蛋白质，从而加速蛋白质的消化；另一方面，Fe3O4 fTiO2核壳结构通过利用Fe3O4独特的磁性和TiO2的强介电特性，可以有效地改善其微波吸收性能，可能的机制是：一旦磁性微球吸收微波后，吸收的微波能量会迅速转移到固定化的胰蛋白酶及其吸附的蛋白质上，同时由于吸附微波能量后的极性分子的振荡作用提高了胰蛋白酶和蛋白质的活性，从而提高了胰蛋白酶的催化效率。3.2.2鼠脑蛋白质的消化用45s微波辅助胰蛋白酶消化试验对鼠脑蛋白样品进行测试，来探讨胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球在实际蛋白质组学中的潜在应用。值得注意的是，小鼠脑中

30、含有大量不同性质的蛋白 41-43 ，其中一些蛋白耐消化。如图7a所示，小鼠处死，提取其脑蛋白，10g的脑蛋白无需任何预分离过程，直接与胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球混合，经45s微波辅助胰蛋白酶消化后，用磁铁分离收集微球，并收集上清消化液用于MS分析。为了初步评估该策略的有效性，部分消化通过MALDI-TOF MS分析，图6b为其质谱图。质谱显示：可以检测到大量的肽，并且它们的分子量集中在1000到2500Da范围内，这就说明小鼠脑蛋白质能够进行有效地消化。然后，进一步通过纳米LC-ESI-MS/MS进行消化蛋白质的鉴定。图S6b为采用45s微波辅助酶解鼠脑蛋白质的总离子色谱图，高

31、强度的离子流进一步证明鼠脑蛋白质能够成功消化。图6c所示为一个鼠脑样本肽的MS（MW = 1235.70）图，它的保留时间为34.885分钟。该肽在MS中为双电荷离子，可以通过串联质谱进一步的鉴定。从串联质谱（图S6d）上可以看到，从前体离子产生的大多数y离子和b离子与理论上预测的峰一致，这进一步确定了lnypvsqvnpr肽序列，再将MS的原始数据发送到具有定义参数的搜索引擎上进行蛋白质识别。数据库搜索后，使用45s微波辅助消解系统的蛋白水解产物中，8029种肽代表1715种蛋白质能够确切的鉴定（P0.01）。如图7b所示，大多数肽的分子量在1000和2500之间，这与飞行时间质谱结果一致。

32、鉴定的蛋白质的分子量（MW）和等电点（PI）信息如图7c所示，大多数蛋白质的分子量在10和200 kDa之间，也可以观察到一些大分子量（ 500 kDa）的蛋白质。这表明，该消化系统对大蛋白也有效，这是因为胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的大孔结构能够快速吸附和包含生物大分子。确定蛋白质的等电点（PI）值在3到12.5范围内，表明胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球消化系统对各种蛋白质消化都适用。以上结果表明，利用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的微波消解系统，能够有效水解多种分子量大小和PI值的底物蛋白。图7d和e根据确定的肽序列，给出了预期消化的统计信息、错误的分解和胰

33、蛋白酶C-末端的频率。如图7d所示，大部分的肽可由预期的末端确定，只有0.1%是非特异性的肽，它们可能由于过度分解产生。图7e所示为错误分解产物的分布。虽然消化在45 s内完成，但是92.75%的肽几乎不存在或只有一个错误的裂解，这就证明了微波辅助胰蛋白酶消化系统的高效性。综上所述，使用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的微波辅助胰蛋白酶消化系统可以用于鼠脑蛋白质的快速消化。图7.（a）45s微波辅助胰蛋白酶消化和使用胰蛋白酶固定化Fe3O4 fTiO2微球的鼠脑蛋白质水解示意图；（b）经微波辅助胰蛋白酶消化系统消化后所得肽的分子量分布；（c）所得鼠脑蛋白质的PI分布；（d）和（e）分别

34、为预期的消化和错误的分解所得肽的分布四 结论 总之，介孔/大孔Fe3O4 fTiO2核壳微球是一种新型有效的酶载体。这个简单、快速、有效和可重复使用的微波辅助胰蛋白酶消化系统能够用于模型蛋白质（肌红蛋白，Cty-c，-LG，BSA）和小鼠脑蛋白质的快速消化。由于磁核高效的微波吸收特性以及多孔壳对目标生物分子的高效转移特性，蛋白质能在45s内完成酶解，并且微波辅助胰蛋白酶消化系统对极低量蛋白质的消化也有效。此外，胰蛋白酶固定化后有利于回收利用并具有较高的消化效率。参考文献1 A. Doerr, Clinical proteomics on target, Nat. Methods 6 (2009

35、) 560.2 S. Ray, P.J. Reddy, R. Jain, K. Gollapalli, A. Moiyadi, S. Srivastava, Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and Challenges ahead, Proteomics 11(2011) 21392161.3 L. Beretta, Proteomics from the clinical perspective: many hopes and much debate,

36、 Nat.Methods 4 (2007) 785786.4 A.G. Poth, H.C. Deeth, P.F. Alewood, J.W. Holland, Analysis of the human Casein phosphorproteome by 2-D electrophoresis and MALDI-TOF/TOF MS reveals new phosphoforms, J. Proteome Res. 7 (2008) 50175027.5 H. Zhou, Z. Ning, F. Wang, D. Seebun, D. Figeys, Proteomic reacto

37、rs and their applications in biology, FEBS J. 278 (2011) 37963806.6 S. Wang, B. Wei, P. Yang, G. Chen, Alternating current-assisted on-plate proteolysis for MALDI-TOF MS peptide mapping, Proteomics 8 (2008) 46374641.7 A. Shevchenko, H. Tomas, J. Havlis, J.V. Olsen, M. Mann, In-gel digestion for mass

38、 spectrometric characterization of proteins and proteomes, Nat. Protoc. 1(2006) 28562860.8 J.R. Wisniewski, A. Zougman, N. Nagaraj, M. Mann, Universal sample preparation method for proteome analysis, Nat. Methods 6 (2009), 359-U360.9 M. Hartmann, D. Jung, Biocatalysis with enzymes immobilized on mes

39、oporous hosts: the status quo and future trends, J. Mater. Chem. 20 (2010) 844857.10 G. Yao, C. Deng, X. Zhang, P. Yang, Efficient tryptic proteolysis accelerated by laser radiation for peptide mapping in proteome analysis, Angew. Chem. 122(2010) 83618365.11 G.W. Slysz, D.C. Schriemer, Blending prot

40、ein separation and peptide analysis through real-time proteolytic digestion, Anal. Chem. 77 (2005) 15721579.12 S.A. Ansari, Q. Husain, Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials:a review, Biotechnol. Adv. 30 (2012) 512523.13 H. Hinterwirth, W. Lindner, M. Lammerhofer, Bioconj

41、ugation of trypsin onto gold nanoparticles: effect of surface chemistry on bioactivity, Anal. Chim. Acta733 (2012) 9097.14 C. Yao, L. Qi, W. Hu, F. Wang, G. Yang, Immobilization of trypsin on sub-micron skeletal polymer monolith, Anal. Chim. Acta 692 (2011) 131137.15 B. Malvi, S.S. Gupta, Encapsulat

42、ion of enzyme in large mesoporous material with small mesoporous windows, Chem. Commun. 48 (2012) 78537855.16 F. Xu, W.-H. Wang, Y.-J. Tan, M.L. Bruening, Facile trypsin immobilization in polymeric membranes for rapid, efficient protein digestion, Anal. Chem. 82(2010) 1004510051.17 J. Lee, H.B. Na,

43、B.C. Kim, J.H. Lee, B. Lee, J.H. Kwak, Y. Hwang, J.-G. Park, M.B. Gu, J. Kim, J. Joo, C.-H. Shin, J.W. Grate, T. Hyeon, J. Kim, Magnetically-separable and highly-stable enzyme system based on crosslinked enzyme aggregates shipped in magnetite-coated mesoporous silica, J. Mater. Chem. 19 (2009)786478

44、70.18 S.-Y. Chen, Y.-T. Chen, J.-J. Lee, S. Cheng, Tuning pore diameter of platelet SBA-15 materials with short mesochannels for enzyme adsorption, J. Mater. Chem.21 (2011)56935703.19 S. Xuan, F. Wang, X. Gong, S.-K. Kong, J.C. Yu, K.C.-F. Leung, Hierarchical core/shell Fe3O4SiO2 (-AlOOHAu micro/nan

45、oflowers for protein immobilization, Chem. Commun. 47 (2011) 25142516.20 K. Qian, J. Wan, L. Qiao, X. Huang, J. Tang, Y. Wang, J. Kong, P. Yang, C. Yu, B.Liu, Macroporous Materials as Novel Catalysts for Efficient and Controllable Proteolysis, Anal. Chem.81 (2009) 57495756.21 Z.Zhou,R.N.K.Taylor,S.K

46、ullmann,H.Bao,M.Hartmann,Mesoporousorganosilicas with large cage-like pores for high efficiency immobilization of enzymes,Adv. Mater. 23 (2011) 26272632.22 P. Torres-Salas, A. del Monte-Martinez, B. Cutino-Avila, B. Rodriguez-Colinas, M. Alcalde, A.O. Ballesteros, F.J. Plou, Immobilized biocatalysts

47、: novel approaches and tools for binding enzymes to supports, Adv. Mater. 23 (2011) 52755282.23 S. Hudson, J. Cooney, E. Magner, Proteins in mesoporous silicates, Angew. Chem.Int. Ed. 47 (2008) 85828594.24 J. Ma, C. Hou, Y. Liang, T. Wang, Z. Liang, L. Zhang, Y. Zhang, Efficient proteolysis using a

48、regenerable metal-ion chelate immobilized enzyme reactor supported on organicinorganic hybrid silica monolith, Proteomics 11 (2011) 991995.25 S. Bamrungsap, T. Chen, M. I. Shukoor, Z. Chen, K. Sefah, Y. Chen, W. Tan, Pattern recognition of cancer cells using aptamer-conjugated magnetic nanoparticles

49、, ACS Nano 6 (2012) 39743981.26 R. Hao, R. Xing, Z. Xu, Y. Hou, S. Gao, S. Sun, Synthesis, functionalization, and biomedical applications of multifunctional magnetic Nanoparticles, Adv.Mater. 22 (2010)27292742.27 G. Cheng, J.L. Zhang, Y.L. Liu, D.H. Sun, J.Z. Ni, Synthesis of novelFe3O4SiO2CeO2 micr

50、ospheres with mesoporous shell for phosphopeptide capturing and labeling, Chem. Commun. 47 (2011) 57325734.28 J. Liu, J. Xu, R. Che, H. Chen, M. Liu, Z. Liu, Hierarchical Fe3O4TiO2 yolk-shell microspheres with enhanced microwave-absorption properties, Chem. Eur. J.19 (2013) 67466752.29 H. Zhong, Y.

51、Zhang, Z. Wen, L. Li, Protein sequencing by mass analysis of polypeptide ladders after controlled protein hydrolysis, Nat. Biotechnol. 22(2004)12911296.30 W. Sun, S. Gao, L. Wang, Y. Chen, S. Wu, X. Wang, D. Zheng, Y. Gao,Microwaveassisted protein preparation and enzymatic digestion in proteomics, M

52、ol. Cell.Proteomics 5 (2006) 769776.31 Z. Lu, M. Ye, N. Li, W. Zhong, Y. Yin, Self-assembled TiO2 nanocrystal clusters for selective enrichment of intact phosphorylated proteins, Angew. Chem. Int.Ed. 49 (2010)18621866.32 L. Peng, A.D. Mendelsohn, T.J. LaTempa, S. Yoriya, C.A. Grimes, T.A. Desai, Lon

53、gterm small molecule and protein elution from TiO2 nanotubes, Nano Lett. 9(2009) 19321936.33 P. Si, S. Ding, J. Yuan, X.W. Lou, D.-H. Kim, Hierarchically structured onedimensional TiO2 for protein immobilization, direct electrochemistry, and mediator-free glucose sensing, ACS Nano 5 (2011) 76177626.34 A. Leitner, Phosphopeptide enrichment using m