免疫基础—变形链球菌疫苗的研究进展2002014002童亚楠

1、变形链球菌疫苗的研究进展2002014002 研二队 童亚楠 微生物学摘要：龋病是人类最常见的口腔疾病之一，严重威胁着人群的口腔健康。全国第三次口腔健康流行病学调查显示，我国5岁儿童乳牙患龋率为66O，龋均为35012岁儿童恒牙患龋率为289，龋均为054；3544岁中年人群患龋率为881，龋均(平均龋、失、补指数)为451；6574岁老年人群患龋率为984，龋均(平均龋、失、补指数)为1465。变形链球菌组细菌，主要是Streptococcus mutans 和Streptococcus sobrinus 被认为是最重要的致龋微生物。动物实验和临床研究已证实，通过免疫学干预致龋菌在口腔的定植

2、能够影响龋病的发生，防龋疫苗有望成为一种新的龋病预防措施。根据特异性抗体来源，免疫防龋可分为防龋疫苗主动免疫和被动免疫防龋两种途径。本文就现有的龋齿疫苗做出综述，简单的介绍一下龋病的分子学发生机制和龋齿疫苗的发展历程和现有种类。关键词：龋病，变形链球菌，疫苗一龋病的分子学发病机制龋病是乳酸等有机酸溶解牙釉质和牙本质中的无机物的结果。这些有机酸是口腔生物膜中特定细菌尤其是变异链球菌属(Mutans Streptococci)的代谢终产物, 而变异链球菌广泛存在于人类和其他种系动物的口腔中, 与龋病密切相关。变异链球菌是龋病的主要病原菌之一,变异链球菌表面蛋白对细菌在牙面的初始黏附及菌体之间的聚集

3、起重要作用。有研究证实表面蛋白抗原/的阳性免疫与抗蛋白P1单克隆抗体的阴性免疫都能抑制变异链球菌致龋,因此表面蛋白P1已被看作龋病疫苗开发的潜在抗原1。龋病的发生分为三个阶段。第一阶段为微生物在牙齿表面获得性薄膜上的初始黏附, 此过程受变异链球菌表面蛋白抗原AgI / II(或称PAc )的调节2。第二阶段是依靠于蔗糖和变异链球菌葡糖基转移酶(GTFs)和葡聚糖结合蛋白(GBPs)存在的聚集阶段。在葡聚糖被水解为葡萄糖和果糖后,GTFs合成a-1, 3和a-1, 6葡聚糖。第三阶段, 多价的葡聚糖与变异链球菌表面的GBPs和GTFs中的葡聚糖结合区相互作用, 细菌的大量聚集导致菌斑的形成, 在

4、糖基质存在时, 产生大量的乳酸, 引起釉质脱矿, 龋损形成。二主动免疫防龋主动免疫防龋是以人工接种的方法给机体输入致病的特异性抗原，激发机体的免疫反应，产生与之相对应的特异性抗体，中和致龋菌的毒性因子。用于主动免疫的预防生物制品称为防龋疫苗，传统的防龋疫苗主要是全菌疫苗和亚单位疫苗。由于全菌疫苗诱导的抗体可与心内膜发生交叉反应，未被采用。纯化的亚单位疫苗虽不会引起心脏交叉反应，并可抑制致龋菌的粘附、定植3，但其免疫原性较弱，需皮下、鼻内等多种途径联合免疫才能激发有效的免疫应答。近年来，已研究出新型防龋疫苗，主要包括基因工程重组疫苗、合成多肽疫苗、转基因植物疫苗和DNA 疫苗。1全菌疫苗：早期的

5、防龋疫苗研究，主要是利用变链菌全细胞制备灭活死疫苗和减毒活疫苗。通过对大鼠、猴等实验动物的免疫研究发现，免疫后的动物唾液和血清中抗变链菌抗体水平明显升高，能有效地抑制变链菌在牙面的聚集，降低龋病的发生率。这一时期的研究充分表明，利用变链菌全细胞多价疫苗可防止龋病的发生。但进一步研究显示，与其他链球菌相似，变链菌某些抗原或成分可诱发与人心脏组织发生交叉反应的抗体。2纯抗原亚单位疫苗：80年代开始，随着对变链菌细胞壁各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防龋转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗的研究。研究的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要表面蛋白抗原（pAc或Ag、pl、SpaA等）和葡糖基转

6、移酶（gTase），它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要作用。近10年的大量研究证实，用pAc和gTase主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋病发生率，且纯化的抗原不会介导心脏交叉反应。但研究者发现，由于纯抗原免疫原性较弱，单一免疫常难以同时激发有效的系统和局部免疫反应。因此，学者们尝试了经口服、鼻内注射、皮下注射和腹腔注射等多种途径并加以佐剂进行免疫。卢志山等构建了含变形链球菌表面蛋白抗原唾液结合区(saliva·binding region，SBR)基因的重组原核表达质粒，将其转化大肠杆菌后提取纯化SBR蛋白，通过颌下腺注射途径免疫小鼠后证实能够

7、诱导血清和唾液中特异性抗SBR IgG抗体及唾液中特异性抗SBR IgA抗体。吴补领等,纯化了变形链球菌葡聚糖结合蛋白A(slueanbinding protein A，GbpA)的葡聚糖结合区(slueanbinding domain，GBD)，经皮下免疫大鼠，可显著提高特异性血清IsG和唾液IgX的水平，证明变形链球菌GbpA的GBD具有免疫原性。43. 基因工程重组疫苗基因工程重组疫苗是利用基因重组技术，将PAc、SpaA、GTF 等毒性因子的编码基因片段与质粒载体重组后，置入细菌、酵母等受体细胞，使之携带和表达特异性蛋白抗原。常用的载体菌有减毒鼠伤寒沙门菌和乳链球菌。胡晓莉等5用携带变

8、异链球菌表面抗原蛋白基因片段的重组减毒伤寒沙门菌经口服、皮下、黏膜下等途径免疫定菌鼠，可在鼠血清及唾液中检测到抗PAc 抗体，提示重组减毒伤寒沙门菌可诱导特异性免疫反应。为了增强免疫应答，可以设计融合多个表位的基因工程重组疫苗，如融合变异链球菌PAc 的唾液结合区和GTF 的催化活性区。李富祥等6将PAc 基因的A 区和P 区融合制备AP 重组蛋白(rsAP) ，再经过肠激酶切除质粒融合标签和经镍亲和层析纯化后，得到rsAP 目的蛋白，结果显示，纯化的rsAP 目的蛋白具有较好的抗原性，可与MT8148 抗体血清和rsAP抗体血清发生特异性的免疫反应。4.合成多肽疫苗自90代年以来，随着免疫学

9、、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，从分子水平对变链菌PAc和gTase的认识逐步深入。目前，编码这两种抗原的基因PAc和GTF已被克隆，核苷酸序列已基本清楚。用PAc和gTase分子中与某特定功能相关并具有免疫原性的核酸序列制备多肽防龋疫苗，已成为免疫防龋研究的热门。目前研究证实，PAc分子的N末端唾液结合区（SBR）、粘附功能区（8161213位残基）、A区的T细胞和B细胞抗原决定簇等；gTase分子的氨基末端的酶促区（CAT）、羧基末端的葡聚糖结合区（GLU）和高度保守的酶活性片段（GGY和AND）等是理想的候选多肽。 由于多肽疫苗仅为病原体的单一保护性抗原或某一抗原决定簇，

10、单纯以游离的多肽免疫动物，常不能产生理想的免疫效果，也需将其结合至大分子载体上以增强其免疫原性。将 PAcSBR与CT-B嵌合并以CT为佐剂，经鼻内免疫大鼠，可激发高水平的唾液抗 PAcIgA抗体，并导致实验动物龋活性下降。以SBR与CTA2/b嵌合口服免疫小鼠，也能激发高水平的特异性唾液sIgA和血清IgG抗体。另外大肠杆菌的热不稳定毒素b亚单位（lT-B）也被证实能增加连接的SpaA多肽的免疫原性和生物学活性。 另外，改变多肽结构也是增强其免疫原性的有效手段。Senpuku等（1996）发现将PAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段免疫所激发的抗体

11、rPAc抗体明显升高。因此认为，将多肽偶联成束能显著增强其免疫原性。Smith等（1997）将GTF酶活性片段GGY和AND以赖氨酸为核心分别构建有8条支链结构的多肽疫苗，经唾液腺周围免疫大鼠，结果显示，将抗原决定簇设计成这种结构具有高度的免疫原性，能诱导高水平的特异性唾液IgA抗体，并使动物龋齿发生率显著降低。合成肽疫苗是根据毒性因子基因的核酸序列人工合成多肽抗原，再配以合适的佐剂或载体制成的疫苗。有报道，人工合成的变异链球菌GTF 第549 567 位多肽序列HDS 能刺激实验鼠产生保护性免疫反应，减少龋病发生。Culshaw 等7合成了20 个变异链球菌GTF 的20 位多肽序列片段，其

12、中17 位具有较高的MHC分子结合活性、3 位具有GTF 酶活性，免疫实验鼠显示，MAP11 ( 第847 866位多肽序列) 能诱导强大的免疫应答，抑制GTF 的功能，可显著降低龋病的程度。刘建伟和凌均綮8以PAe多肽(301319)作为抗原，以聚谷氨酸苄酯一聚乙二醇一聚谷氨酸苄酯包裹抗原制备防龋微球疫苗，经I=I服免疫SD大鼠，发现PAc多肽抗原微球疫苗口服组的变形链球茵数及磨牙龋齿Keyes计分均显著低于对照组，尤以光滑面龋的减少更为显著。宋长征等用化学方法合成含有GTF催化和GBD的27个氨基酸残基的肽段，并与佐剂偶联制成疫苗免疫小鼠。结果证明融合多肽疫苗可有效诱导小鼠抗体的产生，其免

13、疫血清不仅可以拮抗GTF的酶活性，而且可以明显抑制变形链球菌的黏附。5. DNA 疫苗DNA疫苗（是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗的优点。同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗9。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA（有时也可是RNA），它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2

14、种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。较早的DNA 疫苗有针对变异链球菌PAc 蛋白A 区和P 区的防龋DNA 疫苗pCIAP，以及同时针对变异链球菌PAc 蛋白A 区、P 区和GTF 蛋白GLU 区的融合防龋DNA 疫苗pGLUAP，经免疫定菌鼠后，均可诱导机体的免疫反应，抑制龋病的发生和发展，且pGLUAP 防龋效果优于pCIAP10。之后樊明文等11又研制出能把抗原靶向引导至树突状细胞的靶向防龋DNA 疫苗pGJAP和临床研究用靶向防龋DNA 疫苗pGJAP/VAX，并证实了pGJAP 在动物体内能正确表达，并且pGJAP较pGLUAP能诱导更强的体液免疫反应，防龋效果更好。苏凌云12等

15、用变形链球茵GbpA的GBD真核表达质粒pcDNA31-GBD经颌下腺周围皮下注射免疫sD大鼠，观察诱导的血清和唾液特异性抗体反应，并采用龋齿动物模型评价疫苗的防龋保护作用，结果表明相对于空白对照组，疫苗免疫组的血清中特异性IgG及唾液中特异性IgA明显升高，实验组龋齿计分明显低于对照组。邢泉等建编码小鼠细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA4)胞外区、人IgG1铰链区与Fc段、变形链球菌(Streptococcus mutans) PAc区和GLU区的靶向防龋质粒(pmGJA-P),构建编码人CD5分子引导序列、人IgGl铰链区

16、与Fc段、PAc区和GLU区的非靶向防龋质粒做为对照(pCDA-P).然后,将BALB/c小鼠分成三组,每组20只,分别经过鼻腔滴注途径给予靶向防龋疫苗(给予pmGJA-P鼻腔滴注),非靶向防龋疫苗(给予pCDA-P滴注)和空质粒组(给予PCI滴注,阴性对照组)。结果显示,靶向防龋疫苗可能通过提高抗原呈递的效果,促进DC细胞的成熟,并由此提高DCs对抗原的摄取和提呈能力,促进DCs的生存,进而加强DCs对T、B细胞的激活,加强粘膜免疫。13三被动免疫被动免疫是直接向机体输入外源性特异抗体，中和致龋菌的毒性因子，使机体免受致龋菌影响的方法。被动免疫的抗体主要包括抗龋齿单抗( 单克隆抗体) 、抗龋

17、齿血清抗体、抗龋齿牛奶抗体、抗龋齿鸡蛋黄抗体、转基因植物抗体等。1.抗龋齿单抗是将小鼠骨髓瘤细胞与经变异链球菌某单一抗原免疫后的小鼠脾细胞融合，融合后的杂交瘤细胞可无限增殖传代，并不断产生抗龋齿单抗。有学者曾将抗变异链球菌表面抗原AgI /II 单抗用于人体试验,发现抗AgI/II单抗可以在一段时间内有效减少或消除变异链球菌在牙面的定植。Rebekah 等(2011)14发现，抗AgI/II 单抗( MAb Guys13) 除对细菌本身作用外，可能还具有免疫调节作用，可改变适应性免疫应答的特异性、亚型和功能活动。2.抗龋齿血清抗体血清中含有IgG 等免疫球蛋白，用变异链球菌或远缘链球菌的抗原成

18、分免疫动物( 牛、兔等) ，能使动物血清中产生IgG 抗体，可将其用于特异性致龋菌的被动免疫。3.抗龋齿牛奶抗体牛乳中含有免疫球蛋白IgG、IgM、IgA，可针对多种致病菌产生被动免疫9。用变异链球菌或远缘链球菌的抗原成分免疫牛，即可使牛乳中产生IgG 等抗体，可用于特异性致龋菌的被动免疫。有报道，用变异链球菌PAc 的A 区和GTF 的GLU 区的融合蛋白多次免疫乳牛，可提高乳汁中的抗体滴度，将其用于人体，能抑制变异链球菌的定植。4.转基因植物抗体运用基因工程技术将特异性抗体分子导入植物细胞基因组中，让转基因植物产生所需抗体，用于局部被动免疫。植物抗体可为具有抗原结合活性的抗体小片段，也可是

19、较大的多聚抗体复合物。Ma 等( 1995)15把抗变异链球菌表面抗原的抗体基因导入烟草，从转基因烟草中得到可引起细菌聚集的杂交IgAG 分子。之后，Conrad 等16将IgAG 用于志愿者，初步证明了转基因烟草表达的特异性IgAG 分子可预防龋病。遵义医学院田源等在获得含目的基因pacA-ctxB, pacP-ctxB的转基因番茄第三代种子的基础上,应用PCR、Western blot、ELISA技术对转基因番茄进行鉴定及目的蛋白浓度测定,进一步对新西兰大白兔进行口服免疫实验,初步探索表达PAcA/CTB、PAcP/CTB嵌合蛋白的转基因番茄免疫大白兔的免疫效果。表达外源目的蛋白的转基因番

20、茄免疫新西兰大白兔后,能有效的诱导动物唾液和血液中特异性抗变异链球菌表面蛋白PAcA、PAcP抗体的产生,转基因番茄表达的嵌合蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB具有较好的免疫原性。 17四，问题与展望虽然氟的推广使用在20世纪7080年代很大程度上降低了美国等工业化国家的龋病流行情况，但至今龋病仍是最为常见的口腔疾患并且影响着60% 90%的学龄儿童和大多数的成年人，在一些发展中国家龋病发病甚至呈现上升趋势。龋病的预防需要综合多种措施，更需要补充新的技术方法。防龋疫苗历经半个世纪的探索追寻、推陈出新，经大量的动物实验和几次小规模的临床研究反复验证，证明是一种安全有效的防龋方法。但任何疫苗在

21、正式应用于人体之前都必须经历I、II、III期临床研究证实其在人体的安全性和有效性，而防龋疫苗还缺乏大规模的临床研究资料。另外，在动物实验中表现优异的黏膜佐剂和投递系统也需要在临床研究中得到验证。预期防龋蛋白疫苗因其高度的安全性可能最早取得突破，有望成为其他防龋措施的有力补充。18参考文献:1 韩慧,张向宇；变异链球菌表面蛋白P1中A区和P区的研究进展, 牙体牙髓牙周病学杂志 , 2011,21(2),106-109.2 陈筑，刘建国等，变异链球菌葡糖基转移酶植物表达质粒p2355-gtfB的构建. 广东牙病防治,2012,20(9),473-4783 Childers NK，Zhang SS

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