实验二动物基因组DNA的提取

1、实验二实验二 动物动物基因组基因组DNADNA的的提取提取一、实验目的一、实验目的1.说出提取真核生物基因组DNA的原理和步骤、现象2.熟练地进行真核生物基因组DNA的提取操作二、实验原理二、实验原理蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，将DNA从细胞中析出并与蛋白质、脂类和糖类等分离，再用饱和氯化钠溶液代替有机溶剂沉淀蛋白质，获得DNA三、仪器三、仪器、材料及、材料及试剂试剂1 1. .仪器仪器主要设备：主要设备：电热恒温干燥箱（烘箱）、低温离心机、移液器（2,10,20,30,200,1000l）、枪头、1ml离心管（灭菌）、塑料离心管架、吸头（灭菌）、高压灭菌锅、冰箱其它用品：其它用品：一次性

2、塑料手套、无粉橡胶手套、小型剪刀、小型镊子2.2.材料、试剂材料、试剂材料：鲤材料：鲤尾鳍尾鳍组织组织试剂：琼脂糖（检测用）、蛋白酶K、溴化乙锭（EB） （检测用） 、Na2EDTA2H2O、Tris base碱(MW 121.1)、十二烷基硫酸钠（SDS）、NaOH、氯化钠、无水乙醇、Tris-HCl 、乙二胺四乙酸（EDTA）。DNA提取所需的试剂配制HOM BufferHOM Buffer：称取29.8g Na2EDTA2H2O 溶于700mL双蒸水中，加入12.1g Tris base碱和5g SDS，NaOH调至pH=8.0，定容至1000mL。蛋白酶蛋白酶K K：15mg蛋白酶K溶

3、于1mL双蒸水，-20冷冻保存。4.5 4.5 M M氯化钠氯化钠：称取263.25g氯化钠溶于700mL双蒸水中，定容至1000mL。7575乙醇乙醇：750mL的无水乙醇溶于200mL的双蒸水，定容至1000mL。 4预冷。TE TE 缓冲液缓冲液：1M Tris-HCl (pH=8.0 ) 2mL，0.5M EDTA (pH=8.0 ) 0.2mL与97.8mL双蒸水混匀。四、实验四、实验步骤步骤（一）动物（一）动物组织材料的采集、保存组织材料的采集、保存( (以鱼类分子材料的采集为例以鱼类分子材料的采集为例) )鳍条鳍条通常采集各鳍条，因为尾鳍采集方便，量较大。1）剪取鳍条（注意鳍条量

4、不要太多，过多脱水不完全，容易造成材料损坏。通常为离心管的一半就可以了）；剪取鳍条前洗净手、剪刀，不要粘附有上一尾鱼的材料，包括鲜血。2）将鳍条放入10mL离心管中 ；3）加入95-100%的酒精（加满）；4）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更换酒精（后2次可依具体情况更换）。5）用中性笔写上标签，编号为“地点编号年月日001”起，如020120728001，其中0（地点编号）2012（年）07（月）08（日）001（当天编号）。将标签放入离心管中。肌肉肌肉1）洗净手、剪刀，不要粘附有上一尾鱼的材料，包括鲜血。2）用剪刀去除鱼类皮肤3）剪取长条形肌肉（不要太厚，可以适当长一些，薄一

5、些，便于脱水、固定DNA）4）将肌肉放入10mL离心管中5）加入95-100%的酒精（加满）；6）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更换酒精（后2次可依具体情况更换）。7）用中性笔写上标签，编号为“地点编号年月日001”起，如020120728001，其中0（地点编号）2012（年）07（月）08（日）001（当天编号）。将标签放入离心管中。鱼类分子样品的保存每个地方，不同鱼类材料放到不同封口袋中保存，注意防止酒精挥发。温度最好保持在4 以下。（二）DNA提取(高盐法) 取0.05-0.1g 左右的尾鳍组织，充分剪碎，放入1.5mL离心管中； 向离心管中加入1015L的蛋白酶K 、5

6、00L的HOM buffer，在55消化至少2-3h，每隔0.5-1h摇动一次； 加500L氯化钠（4.5M），300L氯仿，混5-20min，期间剧烈摇动。13000r/min下离心10min； 转移上清液到新管（大概850L左右），加595L无水异丙醇（0.7volume）,混20min， 13000r/min下离心10min，倒掉上清； 加500L 75乙醇，置5min，13000r/min下离心20min，倒掉上清液； 将试管倒立于吸水纸上，室温下自然干燥； 加50100L的灭菌双蒸水或TE溶解，-20(4)保存。注意事项 （1）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低； （

7、2）离心分离两相时，应保证一定的转速和时间； （3）沉淀后应用75的乙醇洗涤，以除去盐离子等； （4）室温干燥DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）； （5）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解（pH值为8.0，可防止DNA发生酸解，TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase）。五、实验安排五、实验安排本实验一天内可做完。第一次，约2.5h，取样与酶解。酶解完成后，以班级为单位放入1.5mL离心管盒。第二次，约4h，DNA提取。六、实验报告/作业总报告：鲤总报告：鲤DNADNA的提取，检测和？基因的扩增的提取，检测和？基因的扩增 1 1）蛋白酶）蛋白酶K K、7575乙醇的作用是

8、什么？其使用量如何乙醇的作用是什么？其使用量如何掌握？掌握？ 2 2）你的组织材料消化后消化液的颜色、透明度如何？）你的组织材料消化后消化液的颜色、透明度如何？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？ 3 3）在试验的各步骤你看到什么现象？）在试验的各步骤你看到什么现象？ 4 4）叙述高盐法提取动物基因组）叙述高盐法提取动物基因组DNADNA的的步骤步骤。5 5）生物科学专业作业：）生物科学专业作业：DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定实验是人教版全日制普通实验是人教版全日制普通高级中学高级中学生物生物必修二中要求学生掌握并完成的一个重要实验必修二中

9、要求学生掌握并完成的一个重要实验。（1 1）请）请你查阅资料，编制该实验的方案，说明每一步骤的实验目的（可你查阅资料，编制该实验的方案，说明每一步骤的实验目的（可以申请自行到实验室进行具体实验）以申请自行到实验室进行具体实验）。（2 2）为什么）为什么是粗提（粗在什么地方）？并对该实验进一步进行改进以获是粗提（粗在什么地方）？并对该实验进一步进行改进以获得纯度较高的得纯度较高的DNADNA。（3 3）现在）现在如果要进一步地拓展中学生的能力，需要在植物如果要进一步地拓展中学生的能力，需要在植物 提取提取DNADNA，请，请设计一个中学能够开展的生植物设计一个中学能够开展的生植物DNADNA提取实验。提取实验。6 6）生物技术及应用专业作业：在制药企业中，往往需鉴定）生物技术及应用专业作业：在制药企业中，往往需鉴定中药材的来源和纯度。鉴定过程中需要进行中药材的来源和纯度。鉴定过程中需要进行DNADNA提取。请提取。请查阅资料，设计一个在