医学免疫学实验Djp4 免疫标记技术

1、免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术 概念概念：用：用荧光素、酶、同位素荧光素、酶、同位素等等标记标记抗体抗体或或抗原抗原用以用以测定测定相应抗原相应抗原或或抗体抗体的技术称为的技术称为免疫标记技术免疫标记技术。 特点特点：敏感、特异、快速，敏感、特异、快速， 定性、定量、定位定性、定量、定位。免疫印迹免疫印迹技术技术(western blot)(western blot)斑点金技术斑点金技术放射免疫技术放射免疫技术酶免疫酶免疫技术技术（ELISA）免疫荧光技术免疫荧光技术常用免疫标记技术：常用免疫标记技术：直接直接免疫荧光免疫荧光荧光素荧光素直接标记直接标记抗体抗体, 检测检测抗

2、原抗原。AgFluorochromeLabeled AbTissue Section常用的常用的荧光素荧光素主要有：主要有：异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色藻红蛋白藻红蛋白(PE)：桔红色罗丹明（罗丹明（RB200)：红色免疫荧光免疫荧光技术：技术：直接直接免疫荧光，免疫荧光，间接间接免疫荧光免疫荧光间接免疫间接免疫荧光荧光,一抗一抗与标本中与标本中抗原抗原结合，再用结合，再用荧光素标记荧光素标记的的二抗二抗进进行检测。行检测。AgFluorochromeLabeled Anti-IgTissue SectionUnlabeledAb高效、更灵敏高效、更灵敏2. 经济、通用性强

3、经济、通用性强一抗一抗：二抗二抗：以兔源一抗为例 兔兔源源一抗一抗 木瓜/胃蛋白酶 抗体抗体Fc段段（为抗原抗原） 人蛋白：1，2，3 兔/鼠： 抗体抗体1，2，3 羊羊（驴）驴）（二抗）（二抗）免疫动物免疫动物产生抗体产生抗体多抗多抗/单抗单抗兔兔源源/鼠鼠源源抗人抗人抗原抗原种特异性：种特异性：一个一个羊源二抗羊源二抗可识别可识别所有所有兔源一抗兔源一抗，即，即一个一个二抗二抗分子分子可识别可识别一种一种动物动物源的所有一抗。源的所有一抗。 羊抗兔/鼠；驴抗兔/鼠免疫免疫羊羊产生抗体产生抗体恒定区可变区 人工制备抗体的类型 多克隆抗体多克隆抗体抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清抗血清），

4、含有针对不同不同抗原决定簇抗原决定簇的多种抗体分子多种抗体分子。Ag6抗原决定簇抗原决定簇单克隆抗体单克隆抗体（mAb) Khler 和 Milstein 1975年建立的技术，通过杂交瘤技术获得的针对单一抗原决定簇的高特异性抗体高特异性抗体。78抗原加工提呈，抗原肽抗原加工提呈，抗原肽免疫荧光技术免疫荧光技术抗C3二抗二抗补体结合位点补体结合位点见前所述定位定位：对对某蛋白质某蛋白质在细胞的在细胞的定位定位、定量定量（细胞（细胞质质中表达）中表达）荧光染料共定位共定位：对对某某二个二个蛋白质蛋白质在细胞内的在细胞内的定位定位、定量定量免疫荧光可免疫荧光可“定位定位” 、“定性定性” ，借助，

5、借助图像软件图像软件可可进行进行模拟模拟“定量定量”分析分析；酶标记技术免疫组织化学免疫组织化学：“定位定位” “定性定性”、“模拟定量模拟定量”；免疫印迹（免疫印迹（Western blotting）：“定性定性”、“模拟定量模拟定量”；酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA） ：“定量定量”辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺(TMB)+ H2O2有色物质直接法direct ELISA检测抗原抗原： 酶酶直接标记直接标记一抗一抗辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)TMB/OPD + H2O2有色物质抗原抗原一抗一抗邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺(TM

6、B)酶联免疫吸附试验Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)双双抗体夹心法抗体夹心法Sandwich ELISA检测抗原： 有两个一抗。固相载体：固相载体：聚苯乙烯聚苯乙烯微量反应板微量反应板辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)间接法indirect ELISA病人血清病人血清固相载体：固相载体：聚苯乙烯聚苯乙烯微量反应板微量反应板（工业化生产）已知抗原：乙肝表表面面抗原(HBsAg)，二抗二抗： 抗人IgM 或 IgG Fc段抗体如：检测乙肝表面抗体乙肝表面抗体(HBsAb)加病人血清病人血清辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)包被包被洗涤洗涤

7、洗涤洗涤(可省可省)洗涤洗涤(不可省不可省)有色物质有色物质二抗过量二抗过量时，加入时，加入病人血清病人血清后，要不后，要不要洗涤？要洗涤？邻苯二胺(OPD)四甲基联苯胺(TMB)TMB/OPD + H2O2预包被板预包被板空白空白 阴性阴性 阳性阳性 待测待测1 待测待测2间接ELISA法检测血清抗-HBsAb 1.加加血清血清及及对照对照(一抗一抗)第第1孔，孔，空白空白对照，加对照，加洗涤液洗涤液1滴滴第第2孔，孔，阴性阴性对照，加对照，加阴性对照血清阴性对照血清1滴滴 第第3孔，孔，阳性阳性对照，加对照，加阳性对照血清阳性对照血清1滴滴 第第4孔，孔，待检待检血清血清1，加，加待检血清待检血清1滴滴 第第5孔，孔，待检待检血清血清2，加，加待检血清待检血清1滴滴 (不洗，因为二抗过量不洗，因为二抗过量)2.加加酶结合物酶结合物 (酶结合酶结合二抗二抗)加入加入酶结合物酶结合物1滴滴（空白孔不加），混匀，（空白孔不加），混匀，37 C ，20-30min3. 洗板洗板:弃去孔内液体，注满弃去孔内液体，注满洗涤液洗涤液，静置，静置5sec甩干，重复甩干，重复3次次。4.显色显色:每孔加每孔加显色液显色液A、B各各1滴，滴，