第二章 天然药物化学成分提取分离鉴定方法与技术(色谱法)

1、 碳酸钙碳酸钙（固定相）（固定相）色素混合液色素混合液石油醚石油醚 (流动相）流动相）1906年，年，Tsweet发现色谱分离现象发现色谱分离现象色谱柱色谱柱2分离混合物分离混合物精制化合物精制化合物鉴定化合物鉴定化合物 利用混合物中各成分在固定相和移动相利用混合物中各成分在固定相和移动相中中吸附吸附、分配分配及其及其亲和力亲和力的差异而达到分离。的差异而达到分离。固定相固定相移动相移动相被分离被分离 物质物质三者相互关系三者相互关系 利用吸附剂对混合物中各成分分子利用吸附剂对混合物中各成分分子吸附吸附能力能力的差异而达到分离的色谱法。的差异而达到分离的色谱法。物理吸附物理吸附 化学吸附化学吸

2、附 半化学吸附半化学吸附“相似者易吸附相似者易吸附”避免避免氢键形成氢键形成能力能力固定相固定相（吸附剂）（吸附剂）移动相移动相（溶剂溶剂）被分离被分离 物质物质溶溶解解能能力力流动相流动相溶质溶质吸附吸附剂剂吸附作用吸附作用竞争竞争吸附作用吸附作用a a、吸附剂（固定相）、吸附剂（固定相）硅胶（硅胶（silica） SiO2 XH2O 注意：注意：活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。 极性吸附剂，极性吸附剂，最适于分离植物中的碱最适于分离植物中的碱性或中性的亲脂性成分性或中性的亲脂性成分。 吸附特性与硅胶类似，但吸附特性与硅胶类似，但碱性氧化铝碱性氧化铝不宜分

3、离酸性物质不宜分离酸性物质。结构结构：-CH2-CO-NH-n原理原理：氢键吸附学说氢键吸附学说 酰氨基与化合物（羟酰氨基与化合物（羟基、羧基及醌基）形基、羧基及醌基）形成氢键吸附。成氢键吸附。用途用途：分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。影响吸附强弱的因素影响吸附强弱的因素：1 1、流动相：水甲醇或乙醇丙酮氯仿、流动相：水甲醇或乙醇丙酮氯仿稀氨水甲酰胺稀氨水甲酰胺; ;2 2、分子结构：、分子结构：a a、形成氢键数目多，吸附、形成氢键数目多，吸附能力强。能力强。b b、形成分子内氢键，吸附力减弱。、形成分子内氢键，吸附力减弱。C C、芳香化合物中

4、，共轭双键多，吸附牢。、芳香化合物中，共轭双键多，吸附牢。活性炭活性炭（activated carbon） 非极性吸附剂，非极性吸附剂，对非极性物质具有较强对非极性物质具有较强的亲和力，在的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力水中对溶质表现出强的吸附能力。 从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。极性越小，洗脱能力越强。特别适合水溶性物质的分离特别适合水溶性物质的分离。b b、溶、溶 剂剂 （移动相）（移动相）遵循遵循“相似相溶相似相溶”及及“相似者易吸附相似者易吸附”原理：原理：极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈强；极性吸附剂

5、，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈强；非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。c、被分离物质、被分离物质对于极性吸附剂而言：对于极性吸附剂而言：被分离成分极性大，吸附牢，难以洗脱；被分离成分极性大，吸附牢，难以洗脱；被分离成分极性小，吸附力弱，容易洗脱。被分离成分极性小，吸附力弱，容易洗脱。一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强：CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR，C=O，CHO，NH2，OH，COOH四、操作方式四、操作方式 1、薄层色谱法（、薄层色谱法（TLC）* 定义：定义：将吸附剂均匀的铺在平板上，把要分离将吸附剂均匀

6、的铺在平板上，把要分离分析的样品点加到薄层色谱板上，然后用适当的溶分析的样品点加到薄层色谱板上，然后用适当的溶剂系统展开，在一定的条件下显色或直接在日光或剂系统展开，在一定的条件下显色或直接在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到紫外光下观察所获得的斑点，从而达到分离、分析、分离、分析、鉴定鉴定的目的。的目的。1）薄层色谱的吸附剂和支持剂：）薄层色谱的吸附剂和支持剂： 在选用吸附剂或支持剂时，一般是根据在选用吸附剂或支持剂时，一般是根据被分离物质的化学性质来选用。当不了解被被分离物质的化学性质来选用。当不了解被分离物质的化学性质时，可以先选用分离物质的化学性质时，可以先选用最常用最常用的硅胶

7、或氧化铝的硅胶或氧化铝，如果分离效果不好，可再，如果分离效果不好，可再改用其他的吸附剂或支持剂。改用其他的吸附剂或支持剂。 正己烷、环己烷正己烷、环己烷 、四氯化碳、甲苯、氯仿、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水2）薄层色谱的一般操作）薄层色谱的一般操作a a、制板、制板b b、活化、活化c c、点样、点样d d、展开、展开e e、显色、显色f f、计算比移值、计算比移值 C、展开、展开预饱和中预饱和中展开中展开中预防预防 边缘效应边缘效应定义：定义：样品经色谱分离后，某成分从原点至该样品经色谱分离后，某成分从原点至该成分斑点中心

8、的距离与从原点至展开剂前沿的成分斑点中心的距离与从原点至展开剂前沿的距离的比值称为该成分的比移值（距离的比值称为该成分的比移值（RfRf值）。值）。 原点至色谱斑点中心的距离原点至色谱斑点中心的距离 比移值（比移值（Rf值）值） 原点至展开剂前沿的距离原点至展开剂前沿的距离上样量大上样量大，常用于制，常用于制备分离，是分离天然化备分离，是分离天然化学成分最常用的方法。学成分最常用的方法。柱色谱是一种将柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中分离材料装入柱状容器中, ,以适当的洗脱剂进行洗脱以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的而使不同成分得到分离的色谱方法。色谱方法。2、柱色谱、柱色谱*其原

9、理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱法相同。法相同。操作步骤：操作步骤：注意点：上柱的样品须经过注意点：上柱的样品须经过纯化处理纯化处理（过滤、（过滤、萃取、脱色、沉淀等）萃取、脱色、沉淀等）1）装柱）装柱实验室常用的柱内径与柱长之比实验室常用的柱内径与柱长之比通常为通常为1:151:151:201:20。 若柱粗而短，则分离效果较差。若柱粗而短，则分离效果较差。 若柱过长而细，分离效果虽好，若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。但流速慢，消耗时间太长。a a、干法、干法b b、湿法：、湿法：因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，因湿法装柱容易赶走硅

10、胶内的气泡，故一般以湿法装柱较好。故一般以湿法装柱较好。2）上样）上样 梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。 洗脱剂液面高度始终要高于柱面。洗脱剂液面高度始终要高于柱面。 控制洗脱剂流速为匀速。控制洗脱剂流速为匀速。 有色成分收集各色带洗脱液。有色成分收集各色带洗脱液。 无色成分则采用等分收集。无色成分则采用等分收集。 浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合 成分则进一步分离。成分则进一步分离。3）洗脱）洗脱植物色素分离图示植物色素分离图示41 分配色谱法是以液体做固定相，用与其不分配色谱法是以液体做固定相，用与其不相混溶的的溶

11、剂做流动相的相混溶的的溶剂做流动相的液液- -液色谱法液色谱法。利用被分离成分在固定相和流动相中的利用被分离成分在固定相和流动相中的溶解度溶解度不同。不同。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于固定相的成分，移动速度慢。易溶于固定相的成分，移动速度慢。溶溶解解能能力力流动相流动相溶质固定相固定相竞争竞争二、分二、分配色谱中的固定相和配色谱中的固定相和流动相流动相支持剂支持剂固定相固定相流动相流动相待分离物质待分离物质分配色谱分配色谱四要素四要素 在在分配色谱中起到支持和吸着一定量固定分配色谱中起到支持和吸着一定量固定相的作用，相的作用，本身无吸附作用本身无吸附作

12、用。常用支持剂：常用支持剂： 含水含水硅胶硅胶、硅藻土、纤维素、硅藻土、纤维素、滤纸滤纸正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分1 1、正相分配色谱、正相分配色谱 2 2、反相分配色谱、反相分配色谱 48类型类型固定相固定相极性极性流动相流动相极性极性分离速度分离速度正相分配正相分配大大小小极性小的分离速度快极性小的分离速度快反相分配反相分配小小大大极性大的分离速度快极性大的分离速度快先将支持剂和固定相拌匀先将支持剂和固定相拌匀抽滤，除去多余的固定相抽滤，除去多余的固定相将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和

13、将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和湿法装柱湿法装柱洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和v支持剂：惰性物质支持剂：惰性物质v固定相：支持剂吸附的溶剂固定相：支持剂吸附的溶剂v流动相：流动相：事先要用固定相饱和事先要用固定相饱和v装置及操作同吸附薄层色谱，装置及操作同吸附薄层色谱，区别在于制板区别在于制板用的是支持剂不是吸附剂。用的是支持剂不是吸附剂。 系以纸为载体，以纸上所含水分为固定相，系以纸为载体，以纸上所含水分为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。用展开剂进行展开的分配色谱。 v支持支持剂：剂：滤纸（纤维素）滤纸（纤维素）v固定相：固定相：水水v流

14、动相流动相：水饱和有机溶剂：水饱和有机溶剂用作微量分析，特别适合于用作微量分析，特别适合于亲水性较强的成分。亲水性较强的成分。化合物极性越小，化合物极性越小，RfRf值越大；极性越大，值越大；极性越大，RfRf值越小。值越小。离子交换色谱法离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子基团，能离子基团，能可逆性可逆性的与被分离成分上的离的与被分离成分上的离子基团发生交换，使混合成分中子基团发生交换，使混合成分中离子型与非离子型与非离子型物质离子型物质或或具有不同离解度的离子化合物具有不同离解度的离

15、子化合物得到分离。得到分离。液液- -固色谱法固色谱法固定相：离子交换树脂固定相：离子交换树脂流动相：含强离子的水溶液流动相：含强离子的水溶液 分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合物，如生物碱物，如生物碱、有机酸、酚酸、有机酸、酚酸、氨基酸等。氨基酸等。阳离子交换树脂阳离子交换树脂：强酸性（强酸性（-SO-SO3 3-H-H+ +） 弱酸性（弱酸性（-COO-H-COO-H+ +） 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：强碱性（强碱性（-N+-N+（CHCH3 3）3 3ClCl- -） 弱碱性（弱碱性（-NH-NH2 2OHOH，-NH-NH-，-N=-N=

16、） 原理：原理：分子筛。分子筛。固定相：凝胶固定相：凝胶（具多孔网状结构）（具多孔网状结构） 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex Gsephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶（羟丙基葡聚糖凝胶（ sephadex LH-20sephadex LH-20）流动相：流动相： 水或有机溶剂水或有机溶剂59 利用利用大孔树脂具有大孔树脂具有吸附性吸附性和和分子筛分子筛作用，作用，使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不同的化学成分得以同的化学成分得以分离。分离。液液- -固色谱法固色谱法固定相：大孔吸附树脂固定相：大孔吸附树脂流动相：溶剂流动相：溶剂多孔网状

17、结构多孔网状结构吸附能力：分子间作用力吸附能力：分子间作用力 氢键氢键分子筛作用：多孔性质分子筛作用：多孔性质 对极性吸附剂来说，成分极性越大，越难对极性吸附剂来说，成分极性越大，越难洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。在在经典柱色谱法基础上发展起来的一种经典柱色谱法基础上发展起来的一种具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法。具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法。二、气相色谱法二、气相色谱法流动相：气体流动相：气体固定相：液体或固体固定相：液体或固体基本原理：基本原理： 利用利用化学成分在气体与固定相之间吸化学成分在气体与固定相之间吸附能力不同或分配系数不同的差异而分离的附能力不同或分配系数不同的差异而分离的色谱分离方法。色谱分离方法。适用范围：适用范围：沸点低、易挥发的挥发油类沸点低、易挥发的挥发油类成分。成分。1 1、薄层色谱中，吸附剂、被分离物质及溶剂、薄层色谱中，吸附剂、被分离物质及溶剂三者之间的关系如何？三者之间的关系如何？2、聚酰胺分离下列黄酮类化合物时（以聚酰胺