石墨烯-DNA电化学传感器对乳腺癌易感1号基因的灵敏度检测研究

1、石墨烯-DNA电化学传感器用于乳腺癌1号基因灵敏检测的研究P.Abdul Rasheed , N.Sandhyarani （纳米科学研究实验室，纳米科学与技术学院，国立技术学院科泽科德，加尔各答，喀拉拉邦，印度）摘要：一种基于石墨烯的电化学DNA传感器已经被开发出来，并用于乳腺癌相关基因BRCA1的低浓度检测。该DNA传感器采用所谓的“三明治”检测方法，即使捕捉探针（DNA-c）和报告探针（DNA-r）与靶探针（DNA-t）在石墨烯修饰的玻碳电极的夹层中进行杂交。报告探针被偶联在金纳米颗粒上，氧化态的金纳米颗粒则被用于靶探针的电化学检测。该传感器的性能用循环伏安法（CV）和计时电流法进行监测，

2、并已经证实其性能是稳定、可重复且灵敏的，而且它可以检测出高达1飞摩尔的BRCA1基因（5.896毫微微克/毫升）。关键词：石墨烯 电化学生物传感器 DNA传感器 乳腺癌 计时电流法1.引言DNA传感器广泛应用于癌症早期和突变检测的诊断测试，以及基因序列分析，法医调查和医疗评估等领域。在各种各样的DNA传感器中，电化学DNA传感器由于其构造简单，成本低，灵敏度高，小型化等优点而极具吸引力且前景广阔。现在用于固定DNA电极材料各异，包括金电极，修饰电极，其中修饰电极又包括碳纳米管电极和石墨烯修饰的电极等。石墨烯为二维纳米结构，它是一种拥有巨大的潜力电极材料，基于石墨烯拥有比表面积大、导电率高、在室

3、温下的电子迁移率快等优点，其已被广泛用于电化学生物传感器的研究和发展。石墨烯分析能够快速的进行电子转移并为生物分子的固定提供一个无细胞毒性且面积较大的表面。在电催化和传感器方面，在石墨烯/功能石墨烯和生物分子之间通过非共价键的相互作用如-共轭或氢键，使石墨烯在连接各种生物分子方面表现出巨大的潜能。单链DNA（ssDNA）通过键的相互作用直接固定在石墨烯和氧化石墨烯上，研究结果表明，与双链DNA相比，单链DNA和石墨烯有的较强相互作用。此外石墨烯-DNA不易降解，故能够长期保持稳定。乳腺癌1号基因（BRCA1）是能在人体乳腺细胞和其他组织细胞中表达的一种管护基因。如果乳腺癌1号基因中检测到超过数

4、百个突变基因的话，这就意味着有较大的患乳腺癌的风险。BRCA1基因突变能引起约40%的遗传性乳腺癌和超过80%的遗传性乳腺和卵巢癌。目前有关于BRCA1与DNA杂交的电化学灵敏度和选择性的检测的报告都已经被报道，这些报道提出了一种基于使用不同的传感器进行无标记检测BRCA1基因的新型格诺磁电化学分析法。另一项研究指出，在乳腺癌BRCA1基因相关的DNA杂交的检测中，与使用未修饰的电极相比，使用多壁碳纳米管（碳纳米管）修饰的玻碳电极（GCE）能使鸟嘌呤的氧化信号增强。此外，基于丝网印刷石墨电极的单壁碳纳米管（SWCNT）可用于DNA杂交的特定BRCA1基因序列的电化学检测。在本文的研究中，为了检

5、测低浓度的BRCA1基因（靶DNA称为DNA-t）序列，我们制作了一个灵敏度高且结构简单的DNA传感器。该传感器上在5端氨基的DNA-c固定在石墨烯修饰的玻碳电极上（GCE），其中有一半的DNA-t与DNA-c进行杂交固定，另一半的DNA-t与DNA-r在金纳米粒子上形成共轭。最终通过采用循环伏安法监测金纳米颗粒的电化学氧化来检测DNA-t的浓度。2、实验方法2.1 材料寡核苷酸是在IDT公司（美国最大的代客合成核酸供货商）购买，本研究采用如下的碱基序列：捕捉链（DNA-c）：5 CTT TTG TTC 3目标链（DNA-t) ：5 GAA CAA AAG GAA GAA AAT C 3探针链

6、 (DNA-r) ：5 GAT TTT CTT C 3非互补链 (NC) : 5CCT TGT TGG ACT CCC TTC T33碱基错配的互补链 ：(3MM): 5 CAA CAA AAG CAA CAA AAT C 3 石墨粉(>20 um), O-(3-羧丙基)-O-2-(3-巯基丙酰氨基)乙基-聚乙二醇(CPEG)，N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，三磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，都向印度的西格玛奥德里奇购买。氯金酸是从印度的SRL化工公司购买。使用的其他化学品多为分析纯，它们是由印度的菲舍尔科学与默克公司提供。实验的所有过程都使用超

7、纯去离子水。混合缓冲和共轭缓冲液分别用0.1 M NaCl- PBS缓冲液和0.3 M NaCl- PBS缓冲液，0.1 M NaCl- PBS缓冲液由0.1 M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(Ph=7)组成，0.3 M NaCl- PBS缓冲液由0.3 M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液(Ph=7)组成。2.2 仪器 传感器表面进行了扫描电子显微镜（SEM）和SU-6600场发射扫描电镜（日立，日本）的表征，循环伏安法（CV）、计时电流法的检测是在CHI400A系列电化学分析仪（CH仪器公司，德克萨斯，美国）上进行。一个三电极系统采用铂丝作为辅助电极，甘汞电极为参比电极和以修饰玻碳的电极为

8、工作电极。电化学测量是在室温下以扫描速率为100 mV/s进行。2.3 石墨烯的合成 使用天然石墨粉采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯，简要地说即1克的石墨粉加入到23 mL 含98% 的硫酸中，在室温下搅拌过夜，然后100mg硝酸钠添加到混合物中，搅拌30分钟；将混合物放入低与5 C的冰浴中，并缓慢加入3 g 高锰酸钾；加热至3540 C搅拌30分钟，然后在25分钟内向上述混合物中加入46 mL水，最后，140毫升水和10 mL 30% H2O2添加到混合物中抑制进一步的反应。其中混合物中未脱落的石墨可通过反复离心和过滤除去（先用5%的HCl然后用水），最终产物用水彻底清洗并在65C真

9、空中干燥过夜。低温剥离常用于石墨烯转化为氧化石墨烯，将氧化石墨烯粉末放入石英坩埚中在在热空气炉中以180 加热3小时，经过剥离后，我们能明显的感觉到其质量的改变和体积的膨胀。同时，热剥离后石墨烯的含量远远小于氧化石墨烯的含量。通过使用扫描电子显微镜、X-射线衍射和拉曼光谱对氧化石墨烯和石墨烯的分析，证实了多层石墨烯的形成。将合成的石墨烯以0.5 mg/ml分散在二甲基甲酰胺（DMF）水混合物（1:9）中，用于滴涂修饰玻碳电极。2.4 探针链与金纳米粒子的作用过程通过谷氨酸单钠还原法合成金纳米粒子，该反应在pH=7的条件下完成。合成的金纳米粒子以12000转/秒离心30min来提纯，沉淀再分散在

10、0.05 mM CPEG的水溶液中并放置过夜。然后，将样品与相同浓度(0.5 mM) 二氯乙烷（EDC)和NHS混合，震荡2h；未反应的试剂以12000转/秒离心30min并反复洗涤去除，接下来取100uL析出物溶解于600uL的混合缓冲溶液中，加入25 uM DNA-r100uL，在4C下孵育16h。当未反应的DNA不再使用时，通过离心将其分离，并将DNA沉淀溶解于共轭缓冲溶液中，在4 C下保存待用。这些与DNA-r作用的金纳米粒子常用于实验检测，表示为DNA-r.AuNP。2.5 传感器的制备 在修饰前，工作电极需用0.3 um氧化铝浆料抛光，用水彻底冲洗干净，然后分别在异丙醇和水中进行超

11、声预处理。电极清洗干净后，取6 uL石墨烯溶液滴涂到玻碳电极表面，在空气自然晾干保存2h，以此来获得石墨烯修饰的玻碳电极。取1 uM DNA-c溶液 6 uL由石墨烯修饰过的玻碳电极上并在4 C下保温2h。将电极浸入1 M牛血清白蛋白中1分钟，从表面上看，由非特异结合的单链DNA-t 和 DNA-r将被封锁在修饰过的玻碳电极里，继续将DNA-t溶液滴涂在电极表面，在室温下保持一小时。整个固定过程，DNA-t的一半与DNA-c进行杂交另一半与DNA-r.AuNP杂交。DNA-r.AuNP溶液(含10 nM DNA-r)滴涂到电极表面完成杂交过程，将得到的GCE/Gr/DNA-c|DNA-t|DN

12、A-r.AuNP电极用10mM的PBS缓冲液进行彻底清洗，用循环伏安法（CV）和计时电流法进行检测。0.2 M高氯酸（HOCl4）常作为电解质，而扫描电子显微镜（SEM）的分析常用氧化铟锡（ITO）玻璃板代替玻碳电极作为分析的基体。3. 结果与讨论BRCA1基于序列传感器具体制作的各个阶段示意图，如方案1所示。 3.1 扫描电子显微镜（SEM）电极修饰每一阶段的表面特性是通过扫描电子显微镜观察的。杂交DNA-r.AuNP前和后传感器表面的SEM图像，如图1所示。当杂交DNA-r.AuNP后，在SEM图像中电极表面上金纳米颗粒的存在中是显而易见的，这表面DNA-c已固定好，也代表着DNA-t和

13、DNA-r.AuNP有着良好的交联。如图1 b所示金纳米粒子的尺寸在20-25nm范围间。同时，增加DNA-t的浓度，它将允许更多的DNA-r.AuNPs与其杂交，将增加金纳米粒子的数量。图2显示了在最终杂交步骤后各种DNA-t浓度传感器表面的SEM图像，从图中可明显的看出，随着在DNA-t浓度的增加，纳米金的数量也在增加。图1：SEM图 (a)为ITO/graphene/DNA-c|DNA-t和(b)为 ITO/graphene/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP，插图显示的是金纳米粒子放大图像图2： ITO/graphene/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP传感器与D

14、NA-t不同浓度下的SEM图 图(a)1fM, 图(b)100fM, 图(c)10pM and 图(d)1nM.3.2 循环伏安法 每进行一个阶段后，均在5 mM K3Fe(CN)6-0.1M KCl体系中以100 mV/s 测定其循环伏安图，每一个修饰步骤的电流都有明显的变化，这样可很好的确认每次DNA探针的固定和杂交的效果（数据未显示）。DNA-石墨烯电极对特异性基因序列的性能在图3a 中表现，在实验中，DNA-t在GCE/Gr/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP电极上所用的浓度从1 fM 到 1 nM 。同时，我们使用高浓度的DNA-r确保其和探针链DNA充分进行杂交。每次修饰

15、金纳米粒子（10nm）后，图3：DNA-石墨电极循环伏安图 （a）不同浓度的DNA-t （b）修饰DNA-r 和 DNA-r.AuNP电化学测量体系为0.2M高氯酸（HClO4）水溶液，SCE扫描速率为0.1 V/s均要将未与DNA-r杂交的纳米粒子洗净，然后在进行测定。当孵育DNA-r.AuNP以后，由于金纳米粒子的表面上的氧化，将在1.1 V处观察到一个明显的氧化峰。这表明DNA-t 和 DNA-c的杂交以及远处的DNA-r.AuNP和DNA-t杂交导致了一个从金纳米并通过DNA双链到石墨烯的远程的电子转移。随着DNA-t浓度的增加，金纳米粒子能吸附的表面积增加，这将允许更多的D

16、NA-r.AuNP进行杂交。因此，由于金纳米颗粒的氧化峰随DNA-t浓度的增加，以此来灵敏的检测DNA-t，采用这种策略，使用循环伏安我们可以检测到1 fM BRCA1目标基因。此外电化学反应是可逆的，去活化之后，氧化峰便消失；当重新再活化的DNA-t 和DNA-r.AuNP中进行孵育，氧化峰将重新出现。去活化过程如下，首先滴加0.1 M NaOH溶液在电极表面，10秒后用含1% SDS的10mM PBS缓冲溶液冲洗干净，最后用蒸馏水润洗。未修饰金纳米粒子的DNA-r用于杂交则无法观察到氧化峰（如图3b），同时在相同条件下的非互补序列的DNA-t没有显示的氧化峰。正如预期的那样，未杂交DNA-

17、t的DNA-c的电极表面不能与DNA-r.AuNP稳定的结合，即电极表面没有DNA-r.AuNP。3.3 计时电流法 为了进一步研究该传感器的检测能力，使GCE/Gr/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP传感器在不同浓度的DNA-t中以1.1 V条件下测定其计时电流响应情况，结果显示，随着DNA-t的浓度的增加，氧化还原电流强度也在增大，这种变化可以检测到100 aM DNA-t的浓度（如图4a）。在1s时计时电流的响应值强度与DNA-t浓度的对数绘制如图4b的曲线，我们可以看出，DNA-t的浓度从1fM 到 1nM的范围内的对数与该传感器的响应值呈线性关系。 该传感器的选择性检测则使

18、用相同浓度的3MM DNA-t和NC DNA-t代替DNA-t进行测试，在1.1 V条件下，观察到10fM的DNA-t, 3MM DNA-t 和 NC DNA-t的计时电流强度分别为34.1 ± 0.8， 31.17 ± 0.65 和23.16 ± 0.35 uA（如图4c），这一结果证实该传感器对DNA序列具有高度选择性的，可以用于检测错配序列。同时也表明，基于石墨烯的DNA传感器可用于高灵敏度、高选择性的检测特定的DNA序列。该传感器经过两个再生周期后石墨烯层将被剥离，因此我们建议该传感器应作为一次性使用的一次性传感器。为了验证一次性传感器芯片的性能，我们采用

19、的丝网印刷电极（SPE）和恒电位阶跃响应技术，其在补充资料中介绍（图S1），结果表明，SPE/Gr/DNA-c|DNA-t|DNA-r.AuNP传感器灵敏度高，同时SPE的结果可以和修饰电极媲美。 关于BRCA1基因检测所使用的不同的传感器的比较及其特异性列于表1，表明本研究的传感器具有灵敏度高、结构简单性和低的检测限等优良性能。 图4： （a）不同DNA-t浓度下传感器在计时电流法的响应值 （b）氧化电位（1.1 V）的氧化还原电流与DNA-t浓度的对数作图 （c）传感器对NC DNA-t and 3MM DNA-t的选择性研究 （d）条形图表示选择性表一：报道中检测BRCA1基因

20、不同类型的传感器4 结论 目前，利用基于石墨烯的电化学DNA生物传感器已经可以对乳腺癌相关基因BRCA1进行飞摩尔级别的检测，在本实验中我们测试了利用金纳米粒子作为该传感器电化学信号变化标记的有效性，通过循环伏安法（CV）和计时电流法对该传感器的性能进行检测发现，该传感器能检测到最小可达1fM 目标DNA。因其高度的灵敏度和选择性，使得改进后的这种生物传感器能够用于早期的癌症的诊断。致谢感谢印度科学和工业研究委员会及科学技术部提供的资金支持。非常感谢印度哥印拜陀市阿里塔纳米材料实验室的Dr. T.G. Satheesh Babu and Mr. P.V.Suneesh的支持，他们热心的为我们提

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