生物分离初级分离

1、初级分离初级分离生物分离的一般流程生物分离的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) )细胞胞内产物细胞胞内产物细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等) )纯化纯化( (层析、电泳层析、电泳) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤) )浓缩浓缩( (超过滤超过滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性v初级分离：初级分离：是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内提取液（细胞破碎液）及其他各种生物原料中，初步提取目标产物，

2、使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。v初级分离的对象具有体积大、杂质含量高等体积大、杂质含量高等特点，因此初级分离技术应具有操作成本低、适合大操作成本低、适合大规模生产规模生产的优势。v初级分离方法：初级分离方法：固液分离（离心、过滤）、膜固液分离（离心、过滤）、膜分离、萃取、吸附、沉淀分级和泡沫分离等。分离、萃取、吸附、沉淀分级和泡沫分离等。 杂质种类杂质种类a.a.高价无机离子（高价无机离子（CaCa2+2+、MgMg2+2+、FeFe2+2+）b.b.杂蛋白杂蛋白c.c.多糖多糖d.d.色素色素高价无机离子的去除方法高价无机离子的去除方法1.1.CaCa2+ 2+ 草酸、草酸钠草

3、酸、草酸钠形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀2.2.MgMg2+2+三聚磷酸钠三聚磷酸钠形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物3.3.FeFe2+ 2+ 黄血盐黄血盐普鲁士兰沉淀普鲁士兰沉淀杂蛋白的去除方法杂蛋白的去除方法等电点沉淀等电点沉淀：蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。l在酸性溶液中带正电荷；在酸性溶液中带正电荷；l在碱性溶液中带负电荷。在碱性溶液中带负电荷。在某一在某一pHpH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。一般采用等电点沉淀、酸碱沉淀一般采用等电点沉淀、酸碱沉淀l在酸性溶液中，蛋白质与

4、一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；氯酸盐等形成沉淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如如AgAg+ +、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、FeFe3+3+和和PbPb2+2+等形成沉淀。等形成沉淀。酸碱沉淀：使蛋白质与盐或离子形成沉淀。酸碱沉淀：使蛋白质与盐或离子形成沉淀。 酶解法酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。 多糖的去除多糖的去除有色物质的去除有

5、色物质的去除 色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行体后进行。 一、沉淀分级一、沉淀分级v沉淀是指由于物理环境的变化，使溶液中的溶质由液相变成固相析出固相析出的过程。v采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。v沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分沉淀所需成分。沉淀法沉淀法 沉淀法

6、沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。与结晶联系与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。区别区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法连续法或间歇法间歇

7、法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步三步进行：操作步骤操作步骤 首先加入沉淀剂;沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。沉淀法的分类沉淀法的分类v根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：v（1）盐析法；v（2）等电点沉淀法；v（3 3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法；v（4）非离子型聚合物沉淀法；v（5）聚电解质沉淀法；v（6）高价金属离子沉淀法等。 除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生抗生素素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质蛋白质等大分子。蛋白质的表面特性蛋白质的表面特

8、性v蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。v一般而言，小分子蛋白质比大分子蛋白质更易溶解。v蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。v蛋白质是两性高分子两性高分子电解质，主要由20 20 种氨种氨基酸基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨疏水性氨基酸残基基酸残基具有向内部折叠内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏荷电区、亲水区和疏

9、水区构成水区构成。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障v蛋白质周围的水化层可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。v蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）v因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性v蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。静电斥力吸引力蛋白质蛋白质/ /胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中

10、的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。其他沉淀法其他沉淀法金属沉淀法金属沉淀法聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法蛋白质沉淀方法蛋白质沉淀方法有机溶剂盐析法有机溶剂盐析法等电点沉淀法等电点沉淀法中性盐盐析法中性盐盐析法1、用盐析法分离蛋白质的二种方法、用盐析法分离蛋白质的二种方法在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“s”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度）在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级

11、盐析法。（盐析：固定离子强度，改变pH及温度。） 其中，Ks盐析法（改变盐浓度改变盐浓度）由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理前处理。 而盐析法（改变改变pHpH及温度及温度）由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化初步的纯化。选用盐析用盐的几点考虑选用盐析用盐的几点考虑v盐析作用要强盐析作用要强v盐析用盐需有较大的溶解度，能配制高浓度盐析用盐需有较大的溶解度，能配制高浓度v盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的v来源丰富、经济来源丰富、经济盐析后得到的产物，一般需要脱盐（透析、凝胶过脱盐（透析、凝胶过滤等）滤等）处理，

12、才能进行后续的分离操作。 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵、硫酸钠和硫酸铵、硫酸钠和氯化钠氯化钠。 硫酸铵硫酸铵在水中的溶解度很高但具腐蚀性，偏酸性，溶解后溶液pH下降，高pH会释放氨。后处理困难，残留在食品中影响风味，在临床医疗上有毒性，必须完全去除。 硫酸钠硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。 氯化钠氯化钠需要高浓度，1.5-2M。2 2、等电点沉淀、等电点沉淀 在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但

13、对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉淀。（1）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH敏感，易失活（5）在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 许多能与水互溶许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，丙酮、甲醇和乙腈，常用于常用于低低盐浓度下沉盐浓度下沉淀蛋白质淀蛋白质。3、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法图图 pH4.

14、8时人白蛋白在乙醇时人白蛋白在乙醇-水溶液中的溶解度水溶液中的溶解度1加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大静电引力增大，导致凝集和沉淀。2蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂水被溶剂所取代所取代，从而降低了它们的溶解度。3有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露疏水基团暴露于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。机理分析机理分析 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择。大致上以丙酮大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次最佳，乙醇次之，

15、甲醇更次。 蛋白质分子量越高，越容易沉淀出来，所需有机溶剂也越少。 在低离子强度和等电点附近，容易沉淀。 有机溶剂沉析的特点有机溶剂沉析的特点v分辨率高；分辨率高；v溶剂容易分离，并可回收使用；溶剂容易分离，并可回收使用；v产品洁净，不需要脱盐处理；产品洁净，不需要脱盐处理；v容易使蛋白质等生物大分子失活容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在应注意在低温下低温下操作；操作；v成本高成本高 20 20世纪世纪6060年代非离子型聚合物开始用于分离年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使

16、用，量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：如：聚乙二醇聚乙二醇（PEGPEG）、聚乙烯吡咯烷酮（）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、葡聚糖等。、葡聚糖等。 4、非离子型聚合物沉淀法、非离子型聚合物沉淀法 基于基于体积不相容性体积不相容性，即，即PEGPEG分子从溶剂中空分子从溶剂中空间排斥蛋白质，优先水合作用的程度取决于所间排斥蛋白质，优先水合作用的程度取决于所用用PEGPEG的分子大小和浓度，排斥体积与的分子大小和浓度，排斥体积与PEGPEG分子分子大小的平方根有关。大小的平方根有关。 PEGPEG沉淀作用的机理沉淀作用的机理 体系的温度只需控制在室温条件下； 沉淀的颗粒较大，产物易

17、收集；PEG非但不会使大多数蛋白质变性，且可提高其稳定性。 优点优点缺点缺点PEG难从蛋白质溶液中除去。 聚电解质聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。 机理：机理：蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，类似于絮凝絮凝，起架桥作用，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。另外，还有盐析和降低水化程度盐析和降低水化程度的作用。5、聚电解质沉淀法、聚电解质沉淀法1. 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu

18、2+、Zn2+、Cd2+；6、金属沉淀法、金属沉淀法沉淀机理沉淀机理：金属离子与蛋白质分子中的特殊部位金属离子与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。起反应造成的。金属离子沉淀蛋白质可分为三类：金属离子沉淀蛋白质可分为三类：2. 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；3. 与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。 实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。7 7、其它沉淀方法、其它沉淀方法 （1 1）亲和沉淀）亲和沉淀 亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子(免疫配位体、基质、辅酶等)之间高度专一性的相互

19、作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。该方法提供了一个从复杂混合物中分离提取出单一产品的有效方法。 其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。 初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。该技术的三个步骤：该技术的三个步骤：2.2.选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法v选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分下来，而与目的物

20、分开，这种分离方法就称为离方法就称为选择性变性沉淀法。选择性变性沉淀法。3.3.选择性溶剂沉淀法选择性溶剂沉淀法v核酸的沉淀分离，可以选择适宜的溶剂进行处理核酸的沉淀分离，可以选择适宜的溶剂进行处理，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这种方，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这种方法又称为法又称为选择性溶剂沉淀法选择性溶剂沉淀法。选择沉淀方法的依据选择沉淀方法的依据选择沉淀方法时，应从以下几方面综合考虑：选择沉淀方法时，应从以下几方面综合考虑： 沉淀剂是否会引起蛋白质分子破坏；沉淀剂是否会引起蛋白质分子破坏； 沉淀剂本身的性质；沉淀剂本身的性质； 沉淀操作的成本、难易程度；沉淀操作的成本、难易

21、程度； 残留沉淀剂的去除难度，最终产品的产率及纯度残留沉淀剂的去除难度，最终产品的产率及纯度的要求等。的要求等。二、泡沫分离二、泡沫分离泡沫分离又称泡沫吸附分离技术。泡沫分离原理泡沫分离原理泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性(如表面活性剂)或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起(如金属离子、有机化合物、蛋白质和酶等)，在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得以富集，藉气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。分离作用主要取决于组分在气液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异。泡沫分离法的分类泡沫分离法的分类泡沫分离是以气泡为介质，利用组分的表面活性差进行分离的一种分离方法无泡沫分离无泡沫分离是指用鼓泡进行分离，但不一定形成泡沫层，可分鼓泡分馏和溶媒浮选。泡沫分离泡沫分离按分离对象是溶液还是含有固体离子的悬浮液、胶体溶液而分成泡沫分馏和泡沫浮选 。 泡沫浮选泡沫浮选用于分离不溶解的物质，按照被分离对象用于分离不溶解的物质，按照被分离对象是分子还是胶体，是大颗粒还是小颗粒等等，又可是分子还是胶体