生物lu《基因工程的基本操作程序》ppt(新人教版选修)

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成(4) 直接分离法直接分离法(1)从基因文

2、库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因文库？基因文库的种类？基因文库的种类？基因文库怎样构建？基因文库怎样构建？怎样从基因文库中得到我们所需的目怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？的基因？基因组文基因组文库与部分库与部分基因文库基因文库的关系的关系基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中基因中启动子启动子无无有有基因中基因中内含子内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的

3、部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种之间的基物种之间的基因交流因交流可以可以部分基因可以部分基因可以说明说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性性. .原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构( (补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质

4、。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能

5、编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。

6、依据：目的基因的有关信息。如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质 等特性。等特性。（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技术技术。通过此技术，可。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取大量的目的基因。PCR技术技术 概念：概念： 原理原理 前提：前提： 条件条件 方式方式PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制一段已知

7、目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增， 即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板模板DNA（含目的基因）；（含目的基因）；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）；酶）； 引物（两种，与目的基因的起始引物（两种，与目的基因的起始段互补）段互补）n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性变性退火退火延伸

8、延伸利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因DNA复制复制PCR技术技术解旋方式解旋方式场所场所酶酶温度条件温度条件合成对象合成对象解旋酶解旋酶DNA 在高温下变性在高温下变性解旋解旋细胞内（主要在细胞内（主要在细胞核）细胞核）体外（在体外（在PCR扩增仪内）扩增仪内）解旋酶、解旋酶、DNA聚合聚合酶酶耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶细胞内温和条件细胞内温和条件需控制温度需控制温度完整的完整的DNA分子分子短时间内形成大量的短时间内形成大量的DNA片段或基因片段或基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心1、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用

9、a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？以完成任务吗？为什么？ 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在

10、棉花体内没有表达。因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子( (抗抗虫基因首端虫基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子基因的质粒中插入终止子( (抗虫基因末端抗虫基因末端) )，导入，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、

11、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是RNA聚聚合酶识别和结合的位点合酶识别和结合的位点位于基因的末端位于基因的末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大肠杆菌不含大肠杆菌不含抗四环素基因抗四环素基因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大肠杆菌含抗大肠杆菌含抗四环素基因四环素基因证明：证明： 大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的

12、基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因完全培养基完全培养基存活存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同种同种3.3.过程过程: :三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞l转化转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程细胞内维持稳定和表达的过程1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1

13、）农杆菌）农杆菌转化法转化法（采用（采用最多）最多）特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对大多数单子叶植物无感染能力大多数单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细可转移至受体细胞并整合到其染色体上的胞并整合到其染色体上的DNA上上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2）基因枪法基因枪法微弹轰击法微弹轰击法特点：成本高特点：成本高（3）花粉管通道法花粉管通道法特点：简便经济特点：简便经济2、将目的基因导入动物细胞

14、将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：常用菌常用菌：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNACa2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的

15、基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否插入受体细胞导入检测：目的基因是否插入受体细胞DNADNA上上方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利

16、用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成复制原点复制原点 + + 目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15151414DNA分子杂交技术分子杂交技术l原理：原理：碱基互补配对原则碱基互补配对原则l基

17、因探针：基因探针：放射性同位素标记或荧光标记的放射性同位素标记或荧光标记的DNA片段片段l过程：过程：目的基因探针转基因生物目的基因探针转基因生物DNA载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的

18、化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因

19、生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:1、用、用-珠蛋白的珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是探针可以检测出的遗传病是 A镰刀状细胞贫血症镰刀状细胞贫血症 B白血病白血病C坏血病坏血病 D苯丙酮尿症苯丙酮尿症 A2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子

20、等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成合成-珠蛋白的珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段B思考与探究：思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导若将一个抗病基因导入小麦中入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙要加趋化

21、和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的

22、糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产

23、出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA) )。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入含有四环素的培养基上培养大肠

24、杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入珠蛋白基因已进入其中。其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。复习题复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方）将目的基因导入受体细胞有哪些方法法?(试举例说明试举例说明)2）简述农杆菌转化法）简述农杆菌转化法6 6）（）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产多选）人们利用

25、基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（人类胰岛素，这一过程涉及到（ ）A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的筛选出能产生胰岛素的“工程菌工程菌” 7 7）下列哪项不属于基因工程技术的步骤下列哪项不属于基因工程技术的步骤 （ ） A基因转移基因转移 B基因扩增基因扩增C基因检测基因检测 D基因表达基因表达 非编码区非编码区非编

26、码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核PCRPCR技术技术DNADNA复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制起始，复制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水解引物水解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则碱基互补配对碱基互补配对条件条件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPd

27、GTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同点点解旋方解旋方式式氢键在高温下断氢键在高温下断裂，双链全部解裂，双链全部解开开解旋酶催化氢键逐步断裂解旋酶催化氢键逐步断裂场所场所体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶等连接酶等结果结果在短时间内形成在短时间内形成大量的大量的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段

28、片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(cDNA)该生物该生物cDNA文库文库DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋