第四章抗体工程

1、第五节第五节 抗体工程抗体工程 抗体研究的抗体研究的 3 3 个阶段：个阶段：18901890年白喉抗毒素，年白喉抗毒素，多克隆抗体多克隆抗体；19751975年杂交瘤技术年杂交瘤技术单克隆抗体单克隆抗体；19941994年年基因工程抗体基因工程抗体. .抗体库技术抗体库技术 ？ 抗体库技术抗体库技术是指是指用细菌克隆用细菌克隆代替代替B细胞克隆细胞克隆来表达制备各种抗体来表达制备各种抗体。 背景知识：背景知识： 噬菌体展示技术（噬菌体展示技术（phage display techniques,PDT） 即用分子克隆的方法即用分子克隆的方法将外源基因片段插入噬菌体壳蛋将外源基因片段插入噬菌体壳

2、蛋白的非必需区白的非必需区，该基因的表达产物，该基因的表达产物与壳蛋白一起以融与壳蛋白一起以融合蛋白的形式展示于噬菌体颗粒的表面合蛋白的形式展示于噬菌体颗粒的表面，进而通过亲，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质，并实现基因克蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术隆化的一种重要的分子生物学技术 噬菌体展示技术的原理融合蛋白PIII基因型表达型融合蛋白 噬菌体展示技术特点噬菌体展示技术特点： 将各种多肽或蛋白质以融合蛋白将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并

3、展示在噬菌体表面，同时的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得得蛋白质的功能与其基因密码有机的连蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起结在一起。 选择方法： 淘选（Panning)而不是 筛选（Screening)非展示系统 展示系统Solid phase selection with immunotubes BBBBBBvvImmunotubecoated withantigencoated withstreptavidin and biotinylated antigenB生物素淘筛的过程淘筛的过程biotin antige

4、nSolution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidincoated microtitre wells亲合素 Wash to remove unbound phage particles.Elute bound phageAmplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Sequencingd) Affinitye) ActivityE.coli感染和扩增 噬菌体展示技术最关键的优势有三：噬菌体展示技术最关键的优势有三：

5、第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，也可挑选到高亲和力噬菌体； 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集； 第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得蛋白质的序列分析既快速又简便。 噬菌体抗体文库噬菌体抗体文库 利用噬菌体表面呈现技术，将抗体分子片段基因与外壳蛋白基因（基因III或基因VIII）连接，构建表达性基因文库，即为噬菌体抗体展示文库（phage antibody display repertoire）。经筛选可获得特异性抗体基因。 噬菌体抗体库的构建 RNA经反转录PCR(RT-PCR)获取抗体某一特定基因区段.如重链和轻链可变

6、区(VH、VL)基因。 抗体基因的组合形式多为单链抗体scFv，也用连接链(G4S)3，组合成功能分子。 常用: 噬菌粒(phagemid)载体，具有噬菌体和质粒的共同特点。 特点：抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体表面。再感染后，能使目的克隆得以再感染后，能使目的克隆得以扩增。扩增。 琥珀终止码在适当位置上引入载体是抗体库的关键性技术。它可被抑制基因(SupE)抑制而翻译成谷氨酸，故可用含有或不含有SupE基因的菌株筛选和鉴定融合蛋白。而克隆位点后的基因序列则有利于对可溶性表达产物的鉴定和纯化。LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII 抗体分子基因片段的抗体分子基因

7、片段的可溶性表达可溶性表达：在噬菌体抗体在噬菌体抗体呈现中，抗体分子片段在呈现中，抗体分子片段在融合蛋白的融合蛋白的N端端呈游离状态，可呈游离状态，可正确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。正确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。 如果抗体片段基因和外壳蛋白基因（如果抗体片段基因和外壳蛋白基因（III或或VIII）间）间放置放置琥珀琥珀终止密码子终止密码子（TAG），则在），则在不带不带琥珀抑制基因琥珀抑制基因（amber suppressor）的宿主菌中，）的宿主菌中，TAG为终止密码子，为终止密码子，合成的抗体分子蛋白多肽合成的抗体分子蛋白多肽穿过细胞内膜穿过细胞内膜，以可溶蛋白的形，以可溶蛋白的

8、形式式分泌表达分泌表达；而在带有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的；而在带有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗体分子多肽以融合蛋白的形式锚定在噬菌体膜上。抗体分子多肽以融合蛋白的形式锚定在噬菌体膜上。 过程：过程： 抗原固相化；抗原固相化； 对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地扩淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地扩增。增。 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其

9、产物用Western blot分析确定后，就完成了全过程。 抗体基因库的构建和基因筛选的抗体基因库的构建和基因筛选的表面呈现技术表面呈现技术 外源性段基因片克隆到外源性段基因片克隆到丝状噬菌体丝状噬菌体的基因组的基因组DNA中，与噬菌体基因中，与噬菌体基因III（g3）连接，外源性因基蛋白与）连接，外源性因基蛋白与基因基因III融合蛋白呈现在噬菌体表面，融合蛋白呈现在噬菌体表面，外源蛋白保持了外源蛋白保持了原来的构象原来的构象。立体构象这一技术方法为构建抗体基因。立体构象这一技术方法为构建抗体基因库、库、cDNA文库和突变基因文库，文库和突变基因文库，筛选目的基因提供了筛选目的基因提供了快速高

10、效的手段快速高效的手段，标志着基因工程抗体发展的质的飞，标志着基因工程抗体发展的质的飞跃。跃。 1、丝状噬菌体的生物学、丝状噬菌体的生物学 丝状噬菌体（丝状噬菌体（filamentous phage）包括）包括M13、f1、fd等突变体，是一种长丝状病毒颗粒，直径为等突变体，是一种长丝状病毒颗粒，直径为6.5nm。其基。其基因组是一个单链环状因组是一个单链环状DNA，编码，编码10种蛋白质，其中种蛋白质，其中gp3、gp6、gp7、gp8和和gp9 5种蛋白质组成外壳蛋白，种蛋白质组成外壳蛋白，基因基因VIII（gp8）是噬菌体颗粒的主要结构蛋白）是噬菌体颗粒的主要结构蛋白，由大约，由大约70

11、0个形态个形态亚单位围绕病毒基因组呈管状蛋白外壳，其余亚单位围绕病毒基因组呈管状蛋白外壳，其余4种外壳蛋种外壳蛋白分别由基因白分别由基因III、VI、VII、IX编码，各有编码，各有5个拷贝，均个拷贝，均参与噬菌体的组装。在噬菌体的一端还含有数拷贝的次要参与噬菌体的组装。在噬菌体的一端还含有数拷贝的次要衣壳蛋白（衣壳蛋白（gp3）。）。 2、噬菌体呈现中噬菌体外壳蛋白的应用、噬菌体呈现中噬菌体外壳蛋白的应用 在基因在基因III 蛋白和基因蛋白和基因VIII蛋白末端插入外源蛋白，表蛋白末端插入外源蛋白，表达的融合蛋白可呈现在噬菌体表面，达的融合蛋白可呈现在噬菌体表面，不影响噬菌体的功能不影响噬菌

12、体的功能，因而因而gp3和和gp8被应用于噬菌体展示（被应用于噬菌体展示（phage display）。基）。基因因VIII蛋白在噬菌体颗粒外壳上有蛋白在噬菌体颗粒外壳上有2700个拷贝，个拷贝，N-端端15个氨基酸暴露于噬菌体表面，可插入外源蛋白个氨基酸暴露于噬菌体表面，可插入外源蛋白，但外源肽，但外源肽段段多于十肽时多于十肽时会影响蛋白会影响蛋白VIII的功能。基因的功能。基因III蛋白在噬菌蛋白在噬菌体颗粒外壳上有体颗粒外壳上有3-5个拷贝，将外源基因紧靠基因个拷贝，将外源基因紧靠基因III上游，上游，在噬菌体表面表达融合蛋白，在噬菌体表面表达融合蛋白，不影响噬菌体的功能。不影响噬菌体的

13、功能。VH接头DNAVL（1）噬菌体抗体的构建：）噬菌体抗体的构建：抗体抗体Fab和和ScFv均可在噬菌体中表达，均可在噬菌体中表达，并呈现在噬菌体表面。并呈现在噬菌体表面。在在Fab表达呈现时，可将表达呈现时，可将L链基因和链基因和Fd段基因构建于一个载体上，段基因构建于一个载体上，转染大肠杆菌。转染大肠杆菌。Fd段或段或L链基因与噬菌体外壳蛋白基因（基因链基因与噬菌体外壳蛋白基因（基因III或基因或基因VIII）相连，融合蛋白锚定在细菌细胞内膜上，与另一条链）相连，融合蛋白锚定在细菌细胞内膜上，与另一条链（游离状态）结合可形成抗原结合特异性的抗体。（游离状态）结合可形成抗原结合特异性的抗体

14、。在在ScFv表达时，利用表达时，利用PCR技术和技术和DNA接头（接头（linker），可将），可将L链和链和H链的链的V区基因随机重组在一起，再克隆到载体中去表达区基因随机重组在一起，再克隆到载体中去表达ScFv抗体抗体分子片段（分子片段（ScFv基因与基因基因与基因III或或VIII连接），并呈现在噬菌体表连接），并呈现在噬菌体表面利于筛选。面利于筛选。将特异性抗原固相化，用文库的噬菌体与其反应，将特异性抗原固相化，用文库的噬菌体与其反应，经过洗涤、洗脱、收获和纯化表达特异性抗体的噬菌体经过洗涤、洗脱、收获和纯化表达特异性抗体的噬菌体 。 （2）噬菌体抗体的表达载体：）噬菌体抗体的表达载

15、体：用于噬菌体抗体表达的载用于噬菌体抗体表达的载体包括体包括噬菌体载体噬菌体载体和和噬粒噬粒（phagemid）。将抗体片段基）。将抗体片段基因与野生型噬菌体基因因与野生型噬菌体基因III的的5 端连接，可表达与蛋白端连接，可表达与蛋白III N端融合的抗体片段分子，呈现在噬菌体的表面。端融合的抗体片段分子，呈现在噬菌体的表面。噬粒噬粒是含是含噬菌体基因间隔区基因的质粒载体，本身不含噬菌体蛋白噬菌体基因间隔区基因的质粒载体，本身不含噬菌体蛋白编码基因，在导入大肠杆菌后不产生子代噬菌体。当用编码基因，在导入大肠杆菌后不产生子代噬菌体。当用辅辅助噬菌体助噬菌体感染时，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白，可

16、将单感染时，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白，可将单链噬粒链噬粒DNA包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，其外壳蛋白包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，其外壳蛋白呈现抗体分子片段，同时含有呈现抗体分子片段，同时含有gp3和和gp8，并能再次感染大，并能再次感染大肠杆菌而繁殖。噬粒具有质粒特性，带有抗药性基因和复肠杆菌而繁殖。噬粒具有质粒特性，带有抗药性基因和复制起点，便于筛选含目的片段的克隆和在大肠杆菌内的扩制起点，便于筛选含目的片段的克隆和在大肠杆菌内的扩增。增。 （3）噬菌体抗体分子的亲和力成熟：）噬菌体抗体分子的亲和力成熟： 如同模拟体内如同模拟体内B 细胞经抗原多次刺激后产生的抗细胞经抗原多次刺激后产生

17、的抗体亲和力增加一样，由于抗体基因库的容量大，基因体亲和力增加一样，由于抗体基因库的容量大，基因的随机组合及的随机组合及CDR区的碱基突变（可采取区的碱基突变（可采取PCR错配、错配、随机突变等），可获取高亲和力的抗体基因片段。随机突变等），可获取高亲和力的抗体基因片段。 （4）抗体分子基因片段的可溶性表达：）抗体分子基因片段的可溶性表达：在噬菌体抗体呈在噬菌体抗体呈现中，抗体分子片段在现中，抗体分子片段在融合蛋白的融合蛋白的N端端呈游离状态，可正呈游离状态，可正确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。如果抗体片段基因确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。如果抗体片段基因和外壳蛋白基因（和外壳蛋白基因（

18、III或或VIII）间放置）间放置琥珀琥珀终止密码子终止密码子（TAG），则在），则在不带不带琥珀抑制基因（琥珀抑制基因（amber suppressor）的宿主菌中，的宿主菌中，TAG为终止密码子，合成的抗体分子蛋白多为终止密码子，合成的抗体分子蛋白多肽肽穿过细胞内膜穿过细胞内膜，以可溶蛋白的形式，以可溶蛋白的形式分泌表达分泌表达；而在带有；而在带有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗体分子多肽以融合蛋琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗体分子多肽以融合蛋白的形式锚定在噬菌体膜上。白的形式锚定在噬菌体膜上。1模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过1011库

19、容，所以能包含库容，所以能包含B细胞全部克隆。细胞全部克隆。 建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的反转录形成的cDNA扩增，扩增，这是人体多克隆细胞的总这是人体多克隆细胞的总mRNA。 使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。遍性。 抗体的抗体的VH和和VL基因的随机重组也增加了抗体的多基因的随机重组也增加了抗体的多样性。因此，能模拟天然全套抗体库。样性。因此，能模拟天然全套抗体库。二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 2避开了人工免

20、疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能免除使用人工免疫动物和细胞融抗体，因而能免除使用人工免疫动物和细胞融合技术。合技术。3可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中，在噬菌体抗体库技术中，VH和和VL基因的随机基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此，所产生的抗的抗体基因又都来自人体，因此，所产生的抗体必然都是

21、高亲和力的人源化抗体。体必然都是高亲和力的人源化抗体。 单克隆抗体单克隆抗体 噬菌体抗体噬菌体抗体 杂交瘤技术杂交瘤技术 展示技术展示技术宿主细胞宿主细胞: 杂交瘤杂交瘤 细菌细菌筛选范围筛选范围 : 103 107 109时间时间: 几个月几个月 几周几周操作操作: 繁杂繁杂 相对简单相对简单免疫免疫: 必须必须 可避免可避免人源抗体人源抗体: +费用费用: 高高 低低生产量生产量: 有限有限 无限无限基因获取基因获取: 再克隆再克隆 直接直接应用前景应用前景: 有限有限 不可估不可估二、噬菌体展示技术的应用现状二、噬菌体展示技术的应用现状 1. 抗体抗体： 抗狂犬病毒的单链抗体，抗狂犬病毒

22、的单链抗体， 抗抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被抗体可专一性杀死被HIV-1感染并感染并表达有表达有gp120的淋巴细胞的淋巴细胞, 中和响中和响尾蛇毒素的单链抗，尾蛇毒素的单链抗， 等等等等。2. 疫苗：疫苗： 展示在噬菌体表面的展示在噬菌体表面的HIV-1 的的gp120-V3 环环 可像天然抗原一样引起可像天然抗原一样引起显著的免疫应答显著的免疫应答, 等等。等等。3. 多肽类药物：多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒肽，它能中和蛇毒 -bungarotoxin；从；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽库中掏选到一个多肽