实验九细菌鉴定中常用的生理生化反应-反应观察部分

1、菌种鉴定中常用的生理生化反应菌种鉴定中常用的生理生化反应实验目的和内容n了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；中常用的生理生化反应的测定方法；n通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；样性；n了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；其代谢产物在鉴别细菌中的意义；实验仪器,材料和用具n实验仪器实验仪器n3737恒温培养箱、恒温培养箱、2020恒温

2、培养箱（室温代替）。恒温培养箱（室温代替）。n微生物材料微生物材料n大肠杆菌、枯草杆菌这二种菌种的斜面各大肠杆菌、枯草杆菌这二种菌种的斜面各1 1支。支。n试剂试剂n甲基红试剂、甲基红试剂、V VP P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂试剂、吲哚试剂、格里斯试剂( (硝酸盐利用试验硝酸盐利用试验) )、卢戈氏碘液、卢戈氏碘液( (淀粉水解试验淀粉水解试验) )实验仪器,材料和用具n实验用具实验用具n试管：每份每个试验试管：每份每个试验2 2支试验，支试验，7 7个试验共个试验共1414支支。n无菌平皿：每份无菌平皿：每份2 2个个n杜氏小管：每份杜氏小管：每份4 4个。个。n接种环、酒精灯、试管架、记

3、号笔。接种环、酒精灯、试管架、记号笔。实验仪器,材料和用具n培养基培养基1. 1.葡萄糖发酵培养基葡萄糖发酵培养基2. 2.乳糖发酵培养基乳糖发酵培养基3. 3.甲基红甲基红( (葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基) )4. 4.V.PV.P试验试验( (葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基) )5. 5.柠檬酸盐利用试验（柠檬酸盐利用试验）柠檬酸盐利用试验（柠檬酸盐利用试验）6. 6.吲哚试验吲哚试验( (蛋白水培养基蛋白水培养基) )7. 7.淀粉培养基淀粉培养基实验原理细菌生化试验n糖糖( (醇醇) )类发酵试验类发酵试验n 不同的细菌含有发酵不同糖不同的细菌含有发酵不同糖(

4、(醇醇) )的酶，因而发酵的酶，因而发酵糖糖( (醇醇) )的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的酸的产生可利用指示剂来判定产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫加入溴甲酚紫pH5.2(pH5.2(黄色黄色) )一一6.8(6.8(紫色紫色) )，当发酵产，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生气体产生可可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。实验步骤n糖糖(

5、 (醇醇) )类发酵试验类发酵试验n编号编号 在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。组号，下同。n接种接种 取葡萄糖发酵培养基取葡萄糖发酵培养基2 2支，按编号支，按编号1 1支接种大肠杆菌，另支接种大肠杆菌，另1 1支接种枯草杆菌。同样取支接种枯草杆菌。同样取2 2支乳糖发酵培养基，支乳糖发酵培养基，1 1支接种大肠杆支接种大肠杆菌，菌，1 1支接种枯草杆菌。支接种枯草杆菌。n在接种后，在接种后，轻轻摇动试管轻轻摇动试管，使其均匀，使其均匀，防止防止导致的德汉氏导致的德汉氏/ /杜杜氏小管进入氏小管进入气泡气泡。n将已接种

6、好的培养基置将已接种好的培养基置3737温箱中培养温箱中培养24h24h。n观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pHpH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应( (为黄色为黄色) )，若发酵，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管养基中倒置的小玻璃管( (杜氏小管杜氏小管) )中有气体。气体占整个倒置中有气体。气体占整个倒置小玻管的小玻管的1010以上以上。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养。

7、若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。基不发生变化。实验结果糖发酵实验糖发酵实验Carbohydrate fermentationIMViC试验n吲哚试验吲哚试验n甲基红试验甲基红试验n伏伏- -普（普（V.PV.P）试验）试验n柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验n ( (I Indolndol test) test)n( (MMethyl red test)ethyl red test)n( (V Voges-Prokaueroges-Prokauer test) test)n( (C Cirateirate test test）甲基红(Methyl red)试验(简称MR试验)n

8、很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸丙酮酸，丙，丙酮酸再被分解，产生甲酮酸再被分解，产生甲酸酸、乙酸、乳酸等，使培养基、乙酸、乳酸等，使培养基的的pHpH降低到降低到4.24.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是色。因甲基红指示剂变色范围是pH4.4(pH4.4(红色红色) )pH6.2(pH6.2(黄色黄色) )。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇醇等物，则等物，则培养基的培养基的pH

9、pH仍在仍在6.26.2以上，故此时加入甲基红指示剂，以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。呈现黄色。实验步骤实验步骤n甲基红试验甲基红试验(MR(MR试验试验) )n将大肠杆菌和枯草杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨将大肠杆菌和枯草杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，水培养基中，3737培养培养 48h48h，加甲基红指示剂加甲基红指示剂2 2滴，滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。性。Methyl Red TestV.P试验n测定某些细菌利用葡萄糖产生测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末非酸性或中性末端产物端产物的能力，如的能力，如丙

10、酮酸丙酮酸。丙酮酸进行缩合、。丙酮酸进行缩合、脱羧生成脱羧生成乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇，该物质在，该物质在碱性碱性条件下条件下被空气中的氧气氧化成被空气中的氧气氧化成二乙酰二乙酰，二乙酰与蛋白，二乙酰与蛋白胨中精氨酸中的胍基作用生成胨中精氨酸中的胍基作用生成红色化合物红色化合物。实验步骤n伏伏- -普二氏试验普二氏试验(V.P (V.P 试验试验) )n 将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，3737培养培养48h48h，取出，取出，倒掉一半培养液倒掉一半培养液，加，加入入4040KOH 5KOH 51010滴，然后再加入（总体滴，然后再加入（总体积）等量

11、的积）等量的5 5 - -萘酚溶液，用力振荡，再萘酚溶液，用力振荡，再放入放入3737水浴锅中保温水浴锅中保温151530min30min，以加快，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏普反应速度。若培养物呈现红色，为伏普反应阳性。反应阳性。Voges-Proskauer Test实验原理有机酸盐及氨盐利用试验n柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验n柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为钠为碳的唯一来源碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是。而磷酸二氢铵是氮的唯一来氮的唯一来源源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳

12、源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的培养基中的溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝指示剂（指示剂（PHPH6.06.0时呈黄时呈黄色，色，PHPH在在6.07.06.07.0时为绿色，时为绿色，PH PH 7.67.6时呈蓝色）时呈蓝色）由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。实验步骤n柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验n取少量被检菌接种取少量被

13、检菌接种到柠檬酸盐培养基到柠檬酸盐培养基上，上，3737培养培养24h24h后，后，观察结果。观察结果。培养基培养基变深蓝色者为阳性。变深蓝色者为阳性。培养基不变色，则培养基不变色，则继续培养继续培养7 7天，培养天，培养基仍不变色者为阴基仍不变色者为阴性。性。Citrate Test实验原理n靛基质靛基质( (吲哚吲哚) )试验试验n某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色色氨酸氨酸，产生靛基质，产生靛基质( (吲哚吲哚) )，靛基质与，靛基质与对二甲基对二甲基氨基苯甲醛氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质结合，形成玫瑰色靛基质( (红色化合红色化合物物)

14、)。实验步骤n靛基质靛基质( (吲哚吲哚) )试验试验n将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，3737培养培养24h24h48h48h后，后，加入加入10-2010-20滴乙醚滴乙醚，振荡数，振荡数次，次，静置静置1 13 3分钟，分钟，沿试管壁滴加沿试管壁滴加2 2滴吲哚试滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。剂于培养物液面，观察结果。n出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。Indole Test实验原理大分子物质代谢实验 n淀粉水解试验淀粉水解试验n细菌对细菌对大分子的淀粉大分子的淀粉不能直接利用，须靠产不能直接利用，须靠产生的胞

15、外酶生的胞外酶( (淀粉酶淀粉酶) )将淀粉水解为小分子糊将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖精或进一步水解为葡萄糖( (或麦芽糖或麦芽糖) )，再被，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。色。实验步骤n淀粉水解试验淀粉水解试验n将配制好的淀粉培养基冷却到将配制好的淀粉培养基冷却到5050左右，以无菌左右，以无菌操作制成平板。操作制成平板。n用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。

16、置再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置3737温箱培养温箱培养24h24h。n滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘液均匀铺满滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。粉能力的大小。n3 3号管号管- -甲基红试验甲基红试验: : 加甲基红指示剂加甲基红指示剂2 2滴，观察结果，呈现滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。n4 4号管号管- -伏伏- -普二氏试验普二氏试验

17、: : 倒掉一半培养液倒掉一半培养液，加入，加入4040KOH KOH 5 51010滴，然后再加入（总体积）等量的滴，然后再加入（总体积）等量的5 5 - -萘酚溶液，用力萘酚溶液，用力振荡，再放入振荡，再放入3737水浴锅中保温水浴锅中保温151530min30min。若培养物呈现红。若培养物呈现红色，为伏普反应阳性。色，为伏普反应阳性。n6 6号管号管- -吲哚试验吲哚试验: : 加入加入10-2010-20滴乙醚滴乙醚，振荡数次，静置，振荡数次，静置1 13 3分分钟，钟，沿试管壁滴加沿试管壁滴加2 2滴吲哚试剂滴吲哚试剂于培养物液面，出现红色者为于培养物液面，出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。阳性，出现黄色者为阴性。n平板平板- -淀粉水解试验淀粉水解试验: : 滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘滴加少量卢戈氏碘液于平板上，使碘液均匀