第五讲酶化学

1、 第四讲第四讲 酶化学酶化学 一、概述一、概述酶的定义酶的定义: :细胞产生的生物催化剂细胞产生的生物催化剂, ,主要是蛋白质主要是蛋白质, ,少量少量为核酸。为核酸。已经发现已经发现40004000多种酶，获得数百种酶被结晶多种酶，获得数百种酶被结晶并应用于科学研究或医学检验等中，数十种并应用于科学研究或医学检验等中，数十种酶被应用于生产实践；而且，每年都有新酶酶被应用于生产实践；而且，每年都有新酶被发现。被发现。作为生物催化剂，酶催化化学反应有以下特点作为生物催化剂，酶催化化学反应有以下特点: : 1.1.催化效率高催化效率高反应速率高达反应速率高达10108 810102020，比非生物

2、催化剂高，比非生物催化剂高10107 710101313。例如例如, ,过氧化氢分解成氧和水过氧化氢分解成氧和水以铁为催化剂，反应速率为以铁为催化剂，反应速率为6 61010-4-4；用过氧化氢酶；用过氧化氢酶催化，速率为催化，速率为6 610106 6。n高度专一性高度专一性n即一种酶只作用于一种底物或一类底物即一种酶只作用于一种底物或一类底物n绝对专一性绝对专一性n只作用于一种底物只作用于一种底物相对专一性相对专一性 作用于一种以上的底物。作用于一种以上的底物。基团专一性基团专一性主要选择化学键两端的基团主要选择化学键两端的基团, ,而对化学键不甚敏感而对化学键不甚敏感; ;如如-D-D-

3、葡萄糖苷酶，要求葡萄糖苷酶，要求-葡萄糖苷键的一端必须是葡萄糖苷键的一端必须是葡萄糖；葡萄糖；键专一性键专一性严格要求作用的化学键，对其两端的基团无要求严格要求作用的化学键，对其两端的基团无要求; ;如脂肪酶只要求酯键。如脂肪酶只要求酯键。立体异构专一性立体异构专一性对有立体异构体的底物对有立体异构体的底物( (手性碳原子导致手性碳原子导致) )，酶只作，酶只作用于其中的一个异构体。用于其中的一个异构体。例如，例如，L-L-氨基酸氧化酶只对氨基酸氧化酶只对L-L-氨基酸氧化脱氨，对氨基酸氧化脱氨，对D-D-氨基酸则无作用；氨基酸则无作用；L-L-延胡索酸酶只催化延胡索酸酶只催化L-L-延胡索酸

4、加水生成苹果酸。延胡索酸加水生成苹果酸。n作用条件温和作用条件温和n一般在常温下进行一般在常温下进行, ,n例如水解淀粉：若用酸水解例如水解淀粉：若用酸水解, ,需要需要245245294kPa294kPa压压力和力和140140150150的高温及耐酸设备的高温及耐酸设备; ;n而用淀粉酶水解而用淀粉酶水解, ,则仅需在则仅需在65,65,一般设备即可。一般设备即可。受到严格控制受到严格控制多种因素影响到酶催化的反应活性多种因素影响到酶催化的反应活性例如碱性蛋白酶，在例如碱性蛋白酶，在pH8.5pH8.5活性最大，活性最大，pH8pH8时活时活力即下降为力即下降为75%75%左右；左右； p

5、H6.5pH6.5时已经没有活力。时已经没有活力。来源广泛来源广泛例如蛋白酶，有植物、动物、微生物等来源例如蛋白酶，有植物、动物、微生物等来源二、酶的命名二、酶的命名n包括习惯命名及系统命名包括习惯命名及系统命名n习惯命名习惯命名n根据酶作用的底物、或酶的来源等来命名根据酶作用的底物、或酶的来源等来命名n例如淀粉酶或霉菌淀粉酶或高温淀粉酶或碱性蛋例如淀粉酶或霉菌淀粉酶或高温淀粉酶或碱性蛋白酶白酶n习惯命名简单、易懂、应用历史长，但缺乏系统习惯命名简单、易懂、应用历史长，但缺乏系统性，不容易区别。性，不容易区别。系统命名系统命名由于不断发现新酶，习惯命名已经不能适应酶学发展由于不断发现新酶，习惯

6、命名已经不能适应酶学发展的需要。的需要。19611961年，国际生物化学联合会酶学委员会年，国际生物化学联合会酶学委员会（Enzyme CommissionEnzyme Commission，E.C.E.C.）建议对现有的酶进行系）建议对现有的酶进行系统命名，即：统命名，即：每种酶都给出一个系统名称和习惯名称，每种酶都给出一个系统名称和习惯名称，用文字表示系统名称，要包括：用文字表示系统名称，要包括：酶的底物；酶的底物；底底物之间用物之间用隔开；隔开；催化反应的性质。催化反应的性质。此外，还应写出此外，还应写出底物的构型。底物的构型。如谷丙转氨酶，其系统名称为如谷丙转氨酶，其系统名称为L-L-

7、丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸氨基转移酶。氨基转移酶。如果酶的一个底物是水，则可以省略，如葡萄糖如果酶的一个底物是水，则可以省略，如葡萄糖-内酯水解酶。内酯水解酶。国际系统命名（学名）国际系统命名（学名）根据酶的国际系统分类法根据酶的国际系统分类法, ,将所有已知的酶按照其催化将所有已知的酶按照其催化的反应类型，分成六大类，分别用的反应类型，分成六大类，分别用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6的的编号表示。编号表示。根据底物分子中被作用的基团或键的性质，将每一大根据底物分子中被作用的基团或键的性质，将每一大类分若干亚类；每一亚类又分成若干亚亚类；类分若干亚类；每一亚类又分成若干亚亚

8、类；此外，每个酶还赋予一个发现编号。此外，每个酶还赋予一个发现编号。系统命名的酶由系统名（学名）和一个编号组成，这系统命名的酶由系统名（学名）和一个编号组成，这样一个酶由样一个酶由4 4个数字的组合表征。个数字的组合表征。例如例如E.C.1.1.1.27 E.C.1.1.1.27 ；习惯名；习惯名: :乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶; ;E.C.E.C.国际生物化学联合会酶学委员会国际生物化学联合会酶学委员会第一个第一个1 1表示该酶为氧化还原酶类表示该酶为氧化还原酶类; ;第二个第二个1 1表示该酶为氧化还原酶类中的第一亚表示该酶为氧化还原酶类中的第一亚类类, ,催化醇氧化催化醇氧化; ;第三个第三个

9、1 1表示该酶属于氧化还原酶类第一亚类表示该酶属于氧化还原酶类第一亚类中的第一亚亚类，催化醇脱氢中的第一亚亚类，催化醇脱氢; ;第四个数字表第四个数字表示该酶的编号。示该酶的编号。酶催化的反应酶催化的反应氧化还原酶类（氧化还原酶类（E.C.1）n该类酶催化下列反应该类酶催化下列反应n不仅包括脱氢酶、氧化酶，还包括过氧化物酶、加氢酶等不仅包括脱氢酶、氧化酶，还包括过氧化物酶、加氢酶等A2H+BA+B2HA2H+A+O2H2O22H+2A+O2H2O2A转移酶类转移酶类E.C.2E.C.2A+BABCC+水解酶类水解酶类E.C.3E.C.3AH2O+BAOH+BH裂合酶类裂合酶类 催化底物的裂解或

10、逆反应。底物裂解时，一分为二，催化底物的裂解或逆反应。底物裂解时，一分为二，产物中往往留下双键。在逆反应中，催化某一基团加产物中往往留下双键。在逆反应中，催化某一基团加到这个双键上。到这个双键上。 ABA+B异构酶类异构酶类E.C.5E.C.5n催化各种同分异构体的相互转变催化各种同分异构体的相互转变AB合成酶类合成酶类 催化由两种或两种以上的底物合成一种物质的反应，且催化由两种或两种以上的底物合成一种物质的反应，且必须有必须有ATPATP参加。参加。AB+ ATPAB+ADP+Pi如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸COOHCCH3COOHCH2COO

11、HCO+丙酮酸羧化酶作用机理O+CO2ATPADP+H3PO4三、酶的辅助因子三、酶的辅助因子仅由蛋白质组成的酶，称为简单酶；由蛋白质及非蛋仅由蛋白质组成的酶，称为简单酶；由蛋白质及非蛋白小分子组成的酶，称结合酶；白小分子组成的酶，称结合酶；结合酶中的蛋白部分称酶蛋白，结合酶中的蛋白部分称酶蛋白，非蛋白小分子称辅助非蛋白小分子称辅助因子因子，它又分为辅酶或和辅基。，它又分为辅酶或和辅基。与酶蛋白松散结合，可用透析法除去的小分子叫辅酶与酶蛋白松散结合，可用透析法除去的小分子叫辅酶，如丙酮酸脱氢酶中的如丙酮酸脱氢酶中的NADNAD+ +。与酶蛋白紧密结合（共价、离子键等），不能用透析与酶蛋白紧密结

12、合（共价、离子键等），不能用透析法除去的小分子物质叫辅基法除去的小分子物质叫辅基，如羧肽酶中的锌。，如羧肽酶中的锌。酶蛋白、辅助因子单独存在时均无活性，将两者混酶蛋白、辅助因子单独存在时均无活性，将两者混合，则产生有催化活力的全酶。合，则产生有催化活力的全酶。催化反应时，由酶蛋白确定反应的专一性；辅助因催化反应时，由酶蛋白确定反应的专一性；辅助因子则参与稳定酶蛋白构象、或诱导底物分子正确定子则参与稳定酶蛋白构象、或诱导底物分子正确定向、转移电子、原子、功能基团等。向、转移电子、原子、功能基团等。n四、酶的活性部位（活性中心）四、酶的活性部位（活性中心）酶催化反应时，仅有其分子上的少数氨基酸残酶

13、催化反应时，仅有其分子上的少数氨基酸残基直接参与基直接参与直接参与催化反应的氨基酸残基称直接参与催化反应的氨基酸残基称酶的活性部酶的活性部位（或活性中心）位（或活性中心）活性部位（活性中心）活性部位（活性中心）有两个功能区域：一个有两个功能区域：一个是结合部位，专司与底物结合；是结合部位，专司与底物结合；另一个是催化部位，专司催化作用；另一个是催化部位，专司催化作用；这两个中心往往这两个中心往往并不孤立存在或独立发挥并不孤立存在或独立发挥作用作用，有时结合中心的基团也兼催化中心，有时结合中心的基团也兼催化中心的功能。的功能。酶结合专一性底物的化学键主要就是前面酶结合专一性底物的化学键主要就是前

14、面讲过的离子键、氢键、配位键及疏水相互讲过的离子键、氢键、配位键及疏水相互作用等，作用等，而非共价键。而非共价键。n结合部位结合部位 n酶分子中与底物结酶分子中与底物结合的部位或区域。合的部位或区域。n酶分子中促使底物发生化学变化的部位酶分子中促使底物发生化学变化的部位。n通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。部位或活性中心。n结合部位决定酶的专一性结合部位决定酶的专一性n催化部位决定酶所催化反应的性质。催化部位决定酶所催化反应的性质。催化部位催化部位n调控部位调控部位n酶分子中还存在与调节剂结合的部位，结合后引起酶分酶分子中还存在

15、与调节剂结合的部位，结合后引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。酶的必需基团酶的必需基团必需基团是指使酶表现催化活性所必需的部必需基团是指使酶表现催化活性所必需的部分。分。包括活性部位以及参与维持酶空间构象包括活性部位以及参与维持酶空间构象的氨基酸残基或基团的氨基酸残基或基团。n酶活性部位的必需基团主要包括：酶活性部位的必需基团主要包括：n亲核基团：例如丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯亲核基团：例如丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。基和组氨酸的咪唑基。n酸碱基团：天门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸碱基团：天门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨

16、基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基等。等。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNHH2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH溶菌酶活性中心图溶菌酶活性中心图lX-X-衍射分析发现；胰蛋白酶、胰弹性酶和衍射分析发现；胰蛋白酶、胰弹性酶和胰凝乳蛋白酶的作用机理相似。因为这三胰凝乳蛋白酶的作用机理相似。因为这三个酶的氨基酸顺序有个酶的氨基酸顺序有40%40%是相同的，特别是是相同的

17、，特别是活性部位中活性部位中Ser195Ser195周围的氨基酸顺序，周围的氨基酸顺序，Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-ProGly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro。三个酶都具有三个酶都具有SerSerHisHisAspAsp催化三组合结构，催化三组合结构，因此有相似的催化机理。因此有相似的催化机理。三个酶刚分泌时均无活性，须经过单一肽链的断三个酶刚分泌时均无活性，须经过单一肽链的断裂而被激活。裂而被激活。他们的差异在于其与底物结合专一性的差异；即他们的差异在于其与底物结合专一性的差异；即结合底物的口袋上的差异。结合底物的口袋上的差异。胰蛋白酶胰蛋白酶羧基端为羧基端为LysLy

18、s，ArgArg的肽键的肽键凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶羧基端为羧基端为PhePhe，TyrTyr，TrpTrp及有大及有大的疏水侧链的氨基酸如蛋氨酸的疏水侧链的氨基酸如蛋氨酸弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧基端为羧基端为AlaAla。五、酶的作用机制五、酶的作用机制酶催化与活化能酶催化与活化能n催化过氧化氢分解催化过氧化氢分解n加热使过氧化氢分解，活化能为加热使过氧化氢分解，活化能为7534875348焦耳焦耳/ /摩尔摩尔n以胶态钯为催化剂，活化能降低至以胶态钯为催化剂，活化能降低至4897648976焦耳焦耳/ /摩尔；摩尔；n过氧化氢酶催化，活化能降低至过氧化氢酶催化，活化能降低至83728372焦耳焦

19、耳/ /摩尔。摩尔。n过氧化氢酶的作用，使活化能降低至无催化剂时的过氧化氢酶的作用，使活化能降低至无催化剂时的11%11%，其反应速度增加其反应速度增加1 1亿倍以上。亿倍以上。中间产物学说中间产物学说n当酶与底物相遇时，首先形成不稳定的酶当酶与底物相遇时，首先形成不稳定的酶底物复合物，底物复合物，底物分子处于活化状态，即反应活化能降低；然后复合物底物分子处于活化状态，即反应活化能降低；然后复合物分解，生成产物；酶脱落，再与底物结合。分解，生成产物；酶脱落，再与底物结合。nE + S = ES P + EE + S = ES P + En光谱法已经找到一些中间产物的证据。光谱法已经找到一些中间

20、产物的证据。n如过氧化物酶如过氧化物酶H2O2复合物；过氧化物酶为铁卟啉蛋白，复合物；过氧化物酶为铁卟啉蛋白，有特征吸收光谱。有特征吸收光谱。n加加H2O2前前4 4个吸收峰（个吸收峰（645645、 583583、 548548、 498498）n加入加入H2O2后，吸收光谱发生明显改变，变为两个吸收峰后，吸收光谱发生明显改变，变为两个吸收峰（561561、 530.5530.5）n再加入供氢体抗坏血酸等，体系光谱又发生变化，重新出再加入供氢体抗坏血酸等，体系光谱又发生变化，重新出现在现在645645、 583583、 548548、 498498的吸收峰。的吸收峰。H2O2+抗坏血酸-2H

21、过氧化物酶脱氢抗坏血酸2H2O+n诱导契合学说诱导契合学说n19581958年，由年，由KoshlandKoshland提出，要点是：提出，要点是：n酶活性中心的结构有柔性，与底物结合时，受到底酶活性中心的结构有柔性，与底物结合时，受到底物的诱导，酶构象相应发生改变，从而引起活性部物的诱导，酶构象相应发生改变，从而引起活性部位有关基团空间位置的变化，以便与底物的敏感键位有关基团空间位置的变化，以便与底物的敏感键正确的契合，形成酶正确的契合，形成酶- -底物中间复合物。底物中间复合物。n近年来用近年来用X-X-射线，核磁共振，差示光谱等手段证明射线，核磁共振，差示光谱等手段证明了这种中间产物的存

22、在。了这种中间产物的存在。n如醇脱氢酶（如醇脱氢酶（ADHADH）的底物）的底物NADHNADH在游离状态下，在游离状态下，在在340nm340nm有一吸收峰，加入酶后吸收峰移至有一吸收峰，加入酶后吸收峰移至328nm328nm，再加入巯基试剂对氯汞苯甲酸，又使，再加入巯基试剂对氯汞苯甲酸，又使吸收峰回到吸收峰回到340nm340nm。n电子显微镜下也观察到羧肽酶电子显微镜下也观察到羧肽酶A A的某些残基和的某些残基和底物甘氨酰底物甘氨酰酪氨酸结合；以及溶菌酶的最小酪氨酸结合；以及溶菌酶的最小六糖底物躺在酶分子表面狭长凹穴中的证据。六糖底物躺在酶分子表面狭长凹穴中的证据。4、过渡态互补学说、过

23、渡态互补学说n过渡态理论认为：酶与底物的过渡态互补，过渡态理论认为：酶与底物的过渡态互补，亲和力最强，释放出的结合能使亲和力最强，释放出的结合能使ESES复合物的复合物的反应能级降低，有利于底物分子跨越能垒，反应能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应，实际上这是诱导契合学说的加速酶促反应，实际上这是诱导契合学说的不同版本。不同版本。例如，咪唑和对例如，咪唑和对- -硝基苯乙酸酯的反应是一个双分子反应。硝基苯乙酸酯的反应是一个双分子反应。CH3COONO2NNH.NNHCOCH3+O-NO2+实验结果指出，分子内咪唑基参与的酯解反应速度实验结果指出，分子内咪唑基参与的酯解反应速度比相应的

24、分子间反应速度大比相应的分子间反应速度大 24 24 倍。说明咪唑基与倍。说明咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。NNHCOONO2.ONNH+O-NO2+5、抗体酶、抗体酶n指同时具有抗体及催化功能的蛋白质指同时具有抗体及催化功能的蛋白质n制备方法是：制备方法是：n半抗原（底物类似物）半抗原（底物类似物）+ +蛋白质蛋白质 结合抗结合抗原原 动物免疫动物免疫 单克隆抗体单克隆抗体 O2NOOO+NCO2N-OOOCO2N-OOO+NOH-+PO底物过渡态过渡态类似物酯酶的底物、过渡态及过渡态类似物的结构酶催化机制酶催化机制n酶与底物

25、的邻近定向酶与底物的邻近定向n酶催化底物反应，首先要两者相互接近并形成过酶催化底物反应，首先要两者相互接近并形成过渡态中间复合物。渡态中间复合物。n生理条件下，细胞中底物浓度多在生理条件下，细胞中底物浓度多在0.001mol/L0.001mol/L左左右。但是，在酶活性部位测到的底物浓度则可达右。但是，在酶活性部位测到的底物浓度则可达到到100mol/L100mol/L。n在活性中心，往往有少量水，当底物到达此部位，在活性中心，往往有少量水，当底物到达此部位，即达到高浓度。即达到高浓度。n试验表明，酶与底物形成专一复合物时，酶分子试验表明，酶与底物形成专一复合物时，酶分子与底物分子的构象均改变

26、，使酶分子的结合基团与底物分子的构象均改变，使酶分子的结合基团及催化基团分别与底物敏感键正确排列与定位，及催化基团分别与底物敏感键正确排列与定位，这就是这就是邻近定向邻近定向。n例如碳酸酐酶：例如碳酸酐酶：nCOCO2 2 + H + H2 2O HCOO HCO3 3- - + H + H+ + n该酶由该酶由260260个氨基酸残基组成，为单肽链酶，活性部位个氨基酸残基组成，为单肽链酶，活性部位含含ZnZn2+2+，ZnZn2+2+与活性中心的三个组氨酸残基与活性中心的三个组氨酸残基(94(94、9696、119)119)侧链的氮原子配位，第四个配位体是水或羟基。侧链的氮原子配位，第四个配

27、位体是水或羟基。H H2 2O + COO + CO2 2 HCO HCO3 3- - + H + H+ +H isH isH isOOHCOH isH isH isOOHCOZ n2 +Z n2 +张力和形变张力和形变nX-X-衍射分析证明：酶和底物结合时，底物分子向酶衍射分析证明：酶和底物结合时，底物分子向酶的活性部位靠近，诱导酶的构象发生变化，特别是的活性部位靠近，诱导酶的构象发生变化，特别是活性部位的变化并与之结合；同时，酶也诱导底物活性部位的变化并与之结合；同时，酶也诱导底物分子的敏感键变形，由基态变成易变化的过渡态，分子的敏感键变形，由基态变成易变化的过渡态，从而加速反应进行。从而

28、加速反应进行。n例如羧肽酶例如羧肽酶A An专一从羧基端水解肽链，若羧基端为芳香族氨基专一从羧基端水解肽链，若羧基端为芳香族氨基酸或有大的非极性侧链的氨基酸时最快。酸或有大的非极性侧链的氨基酸时最快。羧肽酶羧肽酶A A是如何识别多肽底物的羧基端的氨基酸？底物是是如何识别多肽底物的羧基端的氨基酸？底物是苯甲酰甘氨酰酪氨酸。酶与底物结合时；苯甲酰甘氨酰酪氨酸。酶与底物结合时；nTyrTyr248248酚羟基酚羟基移动移动1.2nm1.2nm，与底物末端羧基形成氢键，与底物末端羧基形成氢键nArgArg145145移动移动0.2nm0.2nm使其胍基与底物末端羧基形成形成盐键使其胍基与底物末端羧基形

29、成形成盐键nAsnAsn144144的侧链酰胺基也与末端羧基形成氢键的侧链酰胺基也与末端羧基形成氢键 结果使底物结果使底物C-C-端的疏水残基端的疏水残基进入酶的疏水口袋进入酶的疏水口袋内内n底物末端肽键上的羰基与底物末端肽键上的羰基与ArgArg127127侧链的正电荷侧链的正电荷形成盐键形成盐键n与锌离子配位的与锌离子配位的水分子水分子与邻近的与邻近的GluGlu270270形成氢键结合而形成氢键结合而被激活。被激活。酸碱催化酸碱催化n酸碱催化是有机反应中最普遍，最有效的催酸碱催化是有机反应中最普遍，最有效的催化方式。化方式。n在酶催化的反应中，以广义酸或碱催化反应，在酶催化的反应中，以广

30、义酸或碱催化反应，即酶分子的氨基酸残基在特定条件下，通过即酶分子的氨基酸残基在特定条件下，通过给出质子或接受质子，催化化学反应。给出质子或接受质子，催化化学反应。广义酸基团广义酸基团 广义碱基团广义碱基团（质子供体）（质子供体） （质子受体）（质子受体）His His 是酶分子中最活泼的酸碱催化氨基酸残基，其咪唑基在生是酶分子中最活泼的酸碱催化氨基酸残基，其咪唑基在生理条件下，既可给出质子，又可获得质子。理条件下，既可给出质子，又可获得质子。-COOH, -NH3, -SH,+OHNHNH+-COO , -NH2, -S , -.-O-NHN:n例如，胰凝乳蛋白酶的活性部位由例如，胰凝乳蛋白酶

31、的活性部位由SerSer195195，HisHis5757，AspAsp102102三个氨基酸残基组成，三个氨基酸残基组成，X-X-衍射分析表明，衍射分析表明，SerSer195195和和HisHis5757邻近，邻近，AspAsp102102在蛋白质分子内部，也在蛋白质分子内部，也靠近靠近HisHis5757，这三个氨基酸残基构成了催化组合。，这三个氨基酸残基构成了催化组合。n没有底物时，没有底物时，HisHis5757是非离子化的。是非离子化的。亲核攻击亲核攻击（5 5）金属离子的催化作用）金属离子的催化作用六、酶促反应速度及其影响因素酶促反应速度及其影响因素酶促反应速度的测量酶促反应速度

32、的测量单位时间内测定底物的减少量或产物的增加量。单位时间内测定底物的减少量或产物的增加量。反应进程曲线反应进程曲线: :以产物的生成量对反应时间作图。以产物的生成量对反应时间作图。一般是测定其初速度。一般是测定其初速度。酶浓度的影响酶浓度的影响n在酶的最适条件下，若底物浓度足够大，足以使酶在酶的最适条件下，若底物浓度足够大，足以使酶得以饱和，此时，反应速度与酶浓度成正比，即；得以饱和，此时，反应速度与酶浓度成正比，即；Ev酶浓度的影响图酶浓度的影响图底物浓度的影响底物浓度的影响底物浓度的影响是指在酶浓度、底物浓度的影响是指在酶浓度、pHpH、温度等、温度等都不变的条件下进行都不变的条件下进行v

33、S一级反应混合级反应Vmax零级反应米氏方程米氏方程nMichaelisMichaelis和和 MentenMenten根据中间产物学说推导了表示底物浓根据中间产物学说推导了表示底物浓度和反应速度关系的公式，称米氏方程。度和反应速度关系的公式，称米氏方程。E + S ES E + Pk3k2k1v= vmaxSKm+SK1ES=k2ES+k3ESkm=ESES=Et-ESSESv= k3ES v=EtSES=Km+Sk3EtSKm+S = vmaxSKm+S米氏方程的意义和测定米氏方程的意义和测定n由米氏方程可知，当反应速度达到最大反应速度一半时，即由米氏方程可知，当反应速度达到最大反应速度一

34、半时，即v=1/2Vv=1/2Vmaxmax时时nK Km m= =S Sn米氏常数的数学涵义是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。一米氏常数的数学涵义是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。一般用般用mol/Lmol/L或或mmolmmol/L/L表示。表示。n不同酶的不同酶的K Km m不同，同一酶不同底物不同，同一酶不同底物KmKm也不同，但是，对一种底物，一种也不同，但是，对一种底物，一种酶的酶的K Km m是一个特征常数。通过测定是一个特征常数。通过测定K Km m，可以确定酶。，可以确定酶。nK Km m不是不是ESES的解离常数，但是，当的解离常数，但是，当K K2 2KK

35、3 3时，时，K Km mKK2 2 / K / K1 1，可用来表示酶，可用来表示酶与底物的亲和力，与底物的亲和力，K Km m大，表示弱；大，表示弱；K Km m小，表示强。小，表示强。V=Vmax SKm + SK Km m和和V Vmaxmax的求法的求法A A 双倒数作图法双倒数作图法n一一1/v1/v对对1/1/S S做图，纵轴截距为做图，纵轴截距为1/V1/Vmaxmax横轴截距为横轴截距为-1/ K-1/ Km m，直，直线斜率为线斜率为K Km m/V/Vmaxmax。n双倒数法做图有以下几个缺点；双倒数法做图有以下几个缺点；n外推至外推至-1/ K-1/ Km m时，通常到

36、了纸的边缘甚至重新做图；时，通常到了纸的边缘甚至重新做图；n低底物浓度下测定往往不准确，需从低浓度到高浓度全面选择；低底物浓度下测定往往不准确，需从低浓度到高浓度全面选择；n与其它作图法比较，线性偏离少，不利于观察酶的作用机制与其它作图法比较，线性偏离少，不利于观察酶的作用机制 1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V Vmaxmax S S V Vmaxmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v-1/Km斜率斜率=Km/Vmax1/VmaxB Eadie-HofsteeB Eadie-Hofstee做图法做图法n

37、该法将双倒数方程两边同时乘以该法将双倒数方程两边同时乘以v vV Vmaxmax得到得到nv = -Kv = -Km mv/v/S S + V+ Vmaxmaxnv v对对v/v/S S做图，得一直线，斜率为做图，得一直线，斜率为-K-Km m ，纵轴截，纵轴截距为距为V Vmaxmax，横轴截距为，横轴截距为V Vmaxmax/ K/ Km m。v/SvVmax-KmpHpH对酶作用的影响对酶作用的影响最适最适pHpH：指酶表现最大活力时的酸度。：指酶表现最大活力时的酸度。npHpH作用机制；影响蛋白的稳定、活性部位基团解离、作用机制；影响蛋白的稳定、活性部位基团解离、底物分子解离。底物分子

38、解离。v6pH10最适最适pHpH动物酶多在动物酶多在6.56.58 8；植物和微生物酶：多在；植物和微生物酶：多在4.54.56.56.5。最适最适pHpH受底物种类，浓度，缓冲液等的影响。例如细受底物种类，浓度，缓冲液等的影响。例如细菌蛋白酶对明胶，菌蛋白酶对明胶，7.07.0，对蚕蛹蛋白，对蚕蛹蛋白，8.58.5。最适温度vt温度对酶作用的影响温度对酶作用的影响n最适温度下，与温度升高成正比，系数为最适温度下，与温度升高成正比，系数为1-21-2。超过则下降。超过则下降n最适温度：酶促反应速度较长时间保持最大值时的温度。最适温度：酶促反应速度较长时间保持最大值时的温度。n动物酶一般为动物

39、酶一般为37375050；植物酶一般为；植物酶一般为50506060。102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)n最适温度是在一定条件下确定的，因此改变反应条件，最适温度是在一定条件下确定的，因此改变反应条件，也会是最适温度发生变化，例如底物种类，反应时间变也会是最适温度发生变化，例如底物种类，反应时间变化会使最适温度变化。化会使最适温度变化。n机制；在较低温度时，温度升高加速酶分子及底物分子机制；在较低温度时，温度升高加速酶分子及底物分子运动，从而增加碰撞和扩散的机会；运动，从而增加碰撞和扩散的机会；n随

40、着温度增加，酶蛋白变性速度加快，当超过最适温度随着温度增加，酶蛋白变性速度加快，当超过最适温度后，升高温度主要使酶蛋白变性，反应速度下降。后，升高温度主要使酶蛋白变性，反应速度下降。激活剂对酶作用的影响激活剂对酶作用的影响n激活剂：凡能提高酶活力的物质称激活剂。激活激活剂：凡能提高酶活力的物质称激活剂。激活剂多为无机离子或简单的有机物。剂多为无机离子或简单的有机物。n激活剂对酶的作用有选择性，一种激活剂对某种激活剂对酶的作用有选择性，一种激活剂对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能起抑制作用。酶起激活作用，而对另一种酶可能起抑制作用。n激活剂的作用机制：无机离子，多作为酶的辅助因子起激活剂的作用

41、机制：无机离子，多作为酶的辅助因子起激活作用，如碳酸酐酶需锌离子。激活作用，如碳酸酐酶需锌离子。n还原剂：使酶中的二硫键还原成巯基从而提高酶活性，还原剂：使酶中的二硫键还原成巯基从而提高酶活性，如木瓜蛋白酶和如木瓜蛋白酶和HcysHcys，GSHGSH。n生物大分子：如一些蛋白激酶激活某些酶，磷酸化酶生物大分子：如一些蛋白激酶激活某些酶，磷酸化酶b b激酶通过加减磷酸基团激活磷酸化酶。激酶通过加减磷酸基团激活磷酸化酶。n络合剂：解除重金属对酶的一直而增加酶活力，如络合剂：解除重金属对酶的一直而增加酶活力，如EDTAEDTA。抑制剂的作用抑制剂的作用n凡使酶的必需基团或酶活性基团的化学性质改变凡

42、使酶的必需基团或酶活性基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，称而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，称抑制剂。抑制剂。n抑制程度以相对活力分数和抑制分数表征抑制程度以相对活力分数和抑制分数表征n相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）=V=Vi i / V / Vo o（V Vi i为加入抑制剂后的反应速度；为加入抑制剂后的反应速度；V Vo o为不加入抑制剂为不加入抑制剂时的反应速度）。时的反应速度）。n抑制分数（指失去活力的分数）抑制分数（指失去活力的分数）nI = 1 I = 1 = 1 - V = 1 - Vi i / V/ Vo o；抑制作用可分

43、为可逆抑制和不可逆抑制。抑制作用可分为可逆抑制和不可逆抑制。 不可逆抑制不可逆抑制n指抑制剂与酶结合后不能用透析等方法除去抑制剂而恢复指抑制剂与酶结合后不能用透析等方法除去抑制剂而恢复酶活性的抑制。酶活性的抑制。n不可逆抑制剂分为非专一性抑制剂及专一性抑制剂，前者不可逆抑制剂分为非专一性抑制剂及专一性抑制剂，前者作用于酶的一类或几类基团，这些基团包含了必需基团，作用于酶的一类或几类基团，这些基团包含了必需基团，作用后引起酶的失活；作用后引起酶的失活；n后者专一性的作用于酶活性部位，使酶失活。为研究酶活后者专一性的作用于酶活性部位，使酶失活。为研究酶活性部位的重要试剂。两类抑制剂在工农业生产、国

44、防及酶性部位的重要试剂。两类抑制剂在工农业生产、国防及酶学研究中具有重要意义。学研究中具有重要意义。n非专一性抑制剂非专一性抑制剂 A A 有机磷化物有机磷化物n常见的有常见的有DFPDFP，敌敌喂，敌百虫，对硫磷等，通式为；，敌敌喂，敌百虫，对硫磷等，通式为；R1R2OPXOOn这些磷化物作用于蛋白酶或脂肪酶活性中这些磷化物作用于蛋白酶或脂肪酶活性中心的心的Ser-OHSer-OH，从而使酶失活。，从而使酶失活。n例如抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能例如抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能分解为乙酸和胆碱而积累，导致以乙酰胆分解为乙酸和胆碱而积累，导致以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过渡兴奋状

45、碱为传导介质的神经系统处于过渡兴奋状态，即态，即神经中毒神经中毒。又称为神经毒剂。又称为神经毒剂。有机氯和有机砷化物有机氯和有机砷化物n这类抑制剂作用于这类抑制剂作用于HcysHcys-SH-SH，抑制含巯基的酶。例如对，抑制含巯基的酶。例如对氯汞苯甲酸（氯汞苯甲酸（PCMBPCMB）n这类抑制剂可以通过加入过量的含巯基化合物，例如这类抑制剂可以通过加入过量的含巯基化合物，例如HcysHcys，还原型，还原型GSHGSH等加以解除。等加以解除。ESH ClHgCOO-HgCOO-+ESHCln路易斯毒气（路易斯毒气（CHClCHCl=CHAsCl=CHAsCl2 2）是有机砷化合物，它与酶）是

46、有机砷化合物，它与酶的巯基结合导致中毒。解毒的方法同有机氯化合物。的巯基结合导致中毒。解毒的方法同有机氯化合物。n例如：巯基丙醇例如：巯基丙醇EAsCHCHClESHSHSSAsCHCHCl+ClClHClESSAsCHCHClCH2SHCHSHCH2OHESHSHCH2CHSSAsCHCHClCH2OH+C 重金属重金属n如如AgAg+ +、CuCu2+2+、HgHg2+2+、PbPb2+2+、FeFe3+3+等等。在高浓度时，。在高浓度时，能使蛋白质和酶变性失活；在低浓度时，则抑制能使蛋白质和酶变性失活；在低浓度时，则抑制某些酶有作用。某些酶有作用。n可用螯合剂（如可用螯合剂（如EDTAE

47、DTA等）解毒。等）解毒。ESHSH+ Hg2+ESSHg+ 2H烷基化试剂烷基化试剂n这类试剂有一个活泼的卤素原子，具体的有碘这类试剂有一个活泼的卤素原子，具体的有碘乙酸、碘乙酰胺和乙酸、碘乙酰胺和2 2，4-4-二硝基氟苯等。作用的二硝基氟苯等。作用的基团有巯基，氨基，羧基，咪唑基等。基团有巯基，氨基，羧基，咪唑基等。ESHICH2CONH2HICH2CONH2ES+氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和COCOn能与酶中金属离子形成稳定的络合物，抑制酶活能与酶中金属离子形成稳定的络合物，抑制酶活力。例如，氰化物与铁卟啉酶中的铁络合，使酶力。例如，氰化物与铁卟啉酶中的铁络合，使酶失活而阻止细胞呼

48、吸。失活而阻止细胞呼吸。青霉素青霉素n青霉素是一种非专一性的不可青霉素是一种非专一性的不可逆抑制剂，它与糖肽转肽酶活逆抑制剂，它与糖肽转肽酶活性部位的性部位的Ser-OHSer-OH形成共价结合，形成共价结合，使酶失活。而该酶在细菌细胞使酶失活。而该酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖交联，一旦壁合成中使肽聚糖交联，一旦该酶失活，细菌细胞壁的合成该酶失活，细菌细胞壁的合成即受阻，细胞生长被损害，从即受阻，细胞生长被损害，从而起到抗菌作用。而起到抗菌作用。2. 2. 可逆抑制可逆抑制n抑制剂与酶结合后能用透析等方法除去抑制剂而抑制剂与酶结合后能用透析等方法除去抑制剂而恢复酶活性恢复酶活性n分为竞争性抑制

49、、非竞争性抑制和反竞争性抑制。分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。n竞争性抑制竞争性抑制；指抑制剂与底物结构类似，与底；指抑制剂与底物结构类似，与底物竞争酶的活性部位，从而降低酶反应活性。物竞争酶的活性部位，从而降低酶反应活性。ESE SEPIE Ik1k2k3kiki 1ki 2+=ki 2ki 1， 为 E I 的 解 离 常 数ki为 抑 制 剂 常 数 ，vVmaxSKmIKi+1=（）111VmaxvVmaxSKmIKiS+1=（）-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax竞争性抑制剂竞争性抑制剂无抑制剂无抑制剂

50、n竞争性抑制作用改变了竞争性抑制作用改变了K Km m，但不改变，但不改变V Vmaxmax。磺胺类药物。磺胺类药物NNNNH2NOHCH2NHCORR=NHCHCH2CH2CO-OCOOH2-氨 基 -4-羟 基 -6-甲 基 蝶 啶对 -氨 基 苯 甲 酸谷 氨 酸蝶 酸谷 氨 酸叶 酸1258104叶 酸 的 基 本 结 构 和 功 能 位 点延胡索酸盐延胡索酸盐丙二酸丙二酸戊二酸戊二酸草酰琥珀酸草酰琥珀酸 草酸盐草酸盐琥珀酸盐琥珀酸盐非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用n底物和抑制剂与酶结合于不同位点，底物和酶结底物和抑制剂与酶结合于不同位点，底物和酶结合后还可以同抑制剂结合，抑制剂与酶结

51、合后也合后还可以同抑制剂结合，抑制剂与酶结合后也可以和底物结合，形成酶可以和底物结合，形成酶- -底物底物- -抑制剂三元复合抑制剂三元复合物。当结合上抑制剂后三元复合物不能转变成产物。当结合上抑制剂后三元复合物不能转变成产物。这种抑制称非竞争性抑制作用。物。这种抑制称非竞争性抑制作用。扭曲扭曲ESE SEPIE I+SE I S+IKiKiK mK mSvSKm +=VmaxIKi+1）（）vVm axSK mIKi+1=（）111Vm axIKi+1）（n非竞争性抑制剂存在时，非竞争性抑制剂存在时，VmaxVmax减小减小1+1+I I/Ki/Ki倍，但倍，但KmKm不变。不变。-4-20

52、2468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v非非竞争性抑制剂竞争性抑制剂无抑制剂无抑制剂-1/km有非竞争性抑制有非竞争性抑制剂时剂时, ,其纵轴截距其纵轴截距和直线斜率增大，和直线斜率增大，并将随着并将随着I I增增大而增大，这是大而增大，这是用来判断是否非用来判断是否非竞争性抑制剂的竞争性抑制剂的一个根据。一个根据。反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用n抑制剂只与抑制剂只与ESES复复合物结合，但复合物结合，但复合物不能转变成合物不能转变成产物，这种抑制产物，这种抑制称反竞争性抑制。称反竞争性抑制。底物不存在时，底物不存在时，抑制剂不能结合抑制剂不能结合

53、活性部位活性部位抑制剂只能与抑制剂只能与ESES复合物结合复合物结合vVmaxSKm+=111VmaxIKi+1）（SvSKm +=VmaxIKi+1）（八、酶的别构（变构）效应八、酶的别构（变构）效应n1.1.别构效应及别构酶别构效应及别构酶n别构调节：别构调节：酶的非催化部位与化合物可逆非共价酶的非催化部位与化合物可逆非共价结合，导致构象改变，由此改变酶的催化能力，结合，导致构象改变，由此改变酶的催化能力，该作用称为酶的别构调节。该作用称为酶的别构调节。n可通过该方式调节活力的酶称为别构酶（变构可通过该方式调节活力的酶称为别构酶（变构酶）。酶）。2.2.效应物及别构效应效应物及别构效应n效

54、应物：与酶非活性部位可逆结合、导致活性变化。效应物：与酶非活性部位可逆结合、导致活性变化。n效应物通常是小分子代谢物或辅助因子，与酶分子的别构效应物通常是小分子代谢物或辅助因子，与酶分子的别构中心结合后使酶的构象发生改变，从而使酶活性中心对底中心结合后使酶的构象发生改变，从而使酶活性中心对底物的结合及催化作用受到影响，从而调节酶促反应速度或物的结合及催化作用受到影响，从而调节酶促反应速度或代谢过程。这种代谢过程。这种现象现象称为别构效应。称为别构效应。n正别构效应；效应物与酶结合后增加反应速度。正别构效应；效应物与酶结合后增加反应速度。n负别构效应：效应物与酶结合后降低反应速度。负别构效应：效

55、应物与酶结合后降低反应速度。n前者对底物或效应物浓度变化敏感，浓度稍变化即改变酶前者对底物或效应物浓度变化敏感，浓度稍变化即改变酶活力。后者不敏感，达到相同速度要更高底物浓度。活力。后者不敏感，达到相同速度要更高底物浓度。n别构酶的动力学不符合米氏方程，其鉴别可用两种方式别构酶的动力学不符合米氏方程，其鉴别可用两种方式nHillHill系数系数n来源于研究血红蛋白与氧结合的关系，用被底物饱和的百来源于研究血红蛋白与氧结合的关系，用被底物饱和的百分比分比Y Y对反应速度对反应速度S S作图，得作图，得S S型曲线。其经验公式为：型曲线。其经验公式为：nLgYLgY/ /（1-Y1-Y）=nlg=

56、nlgS S-lgK-lgK；K K为平衡常数。为平衡常数。n以以LgYLgY/ /（1-Y1-Y）对对lglgS S做图，得一条直线，其斜率为做图，得一条直线，其斜率为n n，称为称为HillHill系数。米氏酶系数。米氏酶HillHill系数系数=1=1；正别构效应酶；正别构效应酶HillHill系系数数 1 1；负别构效应酶；负别构效应酶 1 1。3.3.别构酶的判断别构酶的判断定量判断法定量判断法RsRs= =（酶与底物结合达（酶与底物结合达90%90%饱和度饱和度时的底物浓度）时的底物浓度）/ /（酶与底物结合达（酶与底物结合达10%10%饱和度饱和度时的底物浓度）时的底物浓度）Rs

57、Rs=81=81，米氏酶；，米氏酶；RsRs 8181，正别构效应酶；，正别构效应酶；RsRs 8181，负别构效应酶。，负别构效应酶。S90% VS10% V= 81S90% VS10% V81S90% VS10% V81第八节第八节 酶活力测定酶活力测定 一、酶活力一、酶活力n又称酶活性，是指酶催化一定的化学反应的能力。又称酶活性，是指酶催化一定的化学反应的能力。n酶活力大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的酶活力大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示。所以酶活力的测定，实际上就是测定酶所催速度来表示。所以酶活力的测定，实际上就是测定酶所催化的化学反应的速度。化的化学

58、反应的速度。n反应速度用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表反应速度用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。一般用单位时间内产物生成量来表示酶催化的反应速示。一般用单位时间内产物生成量来表示酶催化的反应速度比较合适。度比较合适。二、酶活力单位二、酶活力单位n酶活力高低用酶活力单位来表示，即酶活力单位是酶活力高低用酶活力单位来表示，即酶活力单位是表示酶量多少的单位。表示酶量多少的单位。n在实际工作中，酶活力单位往往与所用的测定方法、在实际工作中，酶活力单位往往与所用的测定方法、反应条件等因素有关。因此，酶活力单位以前有很反应条件等因素有关。因此，酶活力单位以前有很多表示方法。多表示方法

59、。例如乳酸脱氢酶活力定义：例如乳酸脱氢酶活力定义：2525，pH7.5pH7.5，每分钟，每分钟A A340340nmnm增加增加0.10.1个单位或个单位或0.50.5个单位为一个活力单位。个单位为一个活力单位。该酶活性也可用丙酮酸的增加量来表示；在最适条该酶活性也可用丙酮酸的增加量来表示；在最适条件下，每分钟增加件下，每分钟增加10mol10mol或或5mol/L5mol/L丙酮酸为一个丙酮酸为一个活力单位。活力单位。19611961年，国际生物化学学会（年，国际生物化学学会（IUBIUB）酶学委员会建议）酶学委员会建议用国际单位（用国际单位（IUIU）。）。n（IUIU）指在最适条件下，

60、每分钟催化指在最适条件下，每分钟催化1mol1mol底物减少或底物减少或1mol1mol产物生成所需要的酶量。产物生成所需要的酶量。n如果酶的底物中有一个以上的可被作用的键或基如果酶的底物中有一个以上的可被作用的键或基团，则一个国际单位指的是每分钟催化团，则一个国际单位指的是每分钟催化1mol1mol的的有关基团或键的变化所需的酶量，温度一般规定有关基团或键的变化所需的酶量，温度一般规定为为2525。19721972年，（年，（IUBIUB）推荐使用一种新的单位）推荐使用一种新的单位KatalKatal，简称，简称KatKat，来表示活力单位。以使，来表示活力单位。以使活力单位与国际单位制中的