化学发光法的原理技术要点及评价应用说课材料

1、 化学发光免疫化学发光免疫(miny)(miny)技术技术第一节第一节 发光发光(f un)(f un)与化学发光与化学发光(f (f un)un)剂剂第二节第二节 发光发光(f un)(f un)酶免疫测定（酶免疫测定（CLEIACLEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssaychemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三节第三节 化学发光化学发光(f un)(f un)免疫测定技术免疫测定技术(CLIA)(CLIA)（chemiluminescence immunoassaychemiluminescence im

2、munoassay） 第四章第四章 电化学发光电化学发光(f un)(f un)免疫测定技术免疫测定技术(ECLI)(ECLI)(electrochemiluminescence immunoassay)(electrochemiluminescence immunoassay)第一页，共27页。 化学发光免疫技术：集灵敏的化学化学发光免疫技术：集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体发光分析和特异的抗原抗体(kngt)(kngt)免疫免疫测测 定于一体的检测技术。定于一体的检测技术。概概 念念 特点：特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、特异性高、敏感性高、分离简便、 快速快速(kui s)(

3、kui s)、试剂无毒、安全稳定、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。可自动化。第二页，共27页。化学发光免疫技术化学发光免疫技术(jsh)(jsh)的类型的类型 按发光剂不同分为按发光剂不同分为(fn wi)(fn wi) 1. 1.发光酶免疫测定（发光酶免疫测定（CLEIACLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2. 2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA) chemiluminescence immunoassay chemiluminesce

4、nce immunoassay 3. 3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分按分离方法不同分 1.1.微粒子化学发光免疫测定微粒子化学发光免疫测定 2.2.磁颗粒化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定第三页，共27页。第一节第一节 发光发光(f un)与化学发光与化学发光(f un)剂剂一、发光一、发光(f un) (f un) 一种物质由电子激发态回复到基一种物质由电子激发态回复到基态时，态时，

5、 释放出的能量表现为光的发射。释放出的能量表现为光的发射。1.1.光照发光光照发光: :发光剂经短波长入射光照射后进入激发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态发态，当回复至基态(j ti)(j ti)时发出较长波长的可见光。时发出较长波长的可见光。2.2.生物发光生物发光: :反应底物在荧光素酶的催化下利用反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATPATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。复到基态时多余的能量以光子形式放出。3.3.化学发光化学发光: :在常温下由化学反应产生的光的发射。在常温下由化学反应产

6、生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程。化学发光是一个多步骤的过程。第四页，共27页。 荧光素酶荧光素酶ATP；O2；Mg2+氧化氧化(ynghu)(ynghu)萤火虫荧光素萤火虫荧光素萤火虫荧光萤火虫荧光(ynggung)(ynggung)素素光光 + AMP+ O2 + CO2 +第五页，共27页。化学发光化学发光 机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射态时，以发射(f

7、sh)(fsh)光子的形式释放能量（即发光）。光子的形式释放能量（即发光）。 化学发光剂或发光底物化学发光剂或发光底物(d w)(d w)：在化学发光反应中：在化学发光反应中参参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。的化合物。 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂第六页，共27页。 能参与化学发光反应；能参与化学发光反应； 与抗原或抗体与抗原或抗体(kngt)(kngt)偶联后形成稳定的结偶联后形成稳定的结合物试剂；合物试剂； 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；偶联后仍保留高的量子效应和反应动

8、力； 应不改变或极少改变被标记物的理化特性，应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。特别是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个化学发光剂应符合以下几个(j )(j )条件条件第七页，共27页。1.1.酶促反应酶促反应(fnyng)(fnyng)的发的发光底物光底物 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIACLEIA中常用的酶有中常用的酶有HRPHRP和和APAP HRP HRP的发光底物有鲁米诺、对的发光底物有鲁米诺、对- -羟基苯乙酸羟基苯乙酸 APAP的发光底物有的发光底物有AMPPDAMPPD、4-MUP4-MUP（荧

9、光底物）（荧光底物） 特点：可作特点：可作(k zu)(k zu)标记物、也可作标记物、也可作(k zu)(k zu)过氧化过氧化物酶的底物物酶的底物 1.1 1.1 鲁米诺鲁米诺H2O2 /OH HRP+N2 + H2O +光光第八页，共27页。对对- -羟基羟基(qingj)(qingj)苯乙酸苯乙酸（HPAHPA） HPA HPA在在H2O2H2O2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚体（荧光氧化成氧化二聚体（荧光(ynggung)(ynggung) 物质），在物质），在350nm350nm激发光作用下，发出激发光作用下，发出450nm450nm波长波长 的荧光的荧光(ynggun

10、g)(ynggung)，可用荧光，可用荧光(ynggung)(ynggung)光度计测光度计测量。量。 1.2 HPA 1.2 HPAH2O2HRP+荧荧 光光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化氧化(ynghu)(ynghu)二聚体二聚体第九页，共27页。AMPPDAMPPD AMPPD AMPPD在碱性条件下，被在碱性条件下，被APAP酶解生成相当稳定酶解生成相当稳定(wndng)(wndng)的的 AMP-DAMP-D阴离子，其有阴离子，其有2 230min30min的分解半衰期，发的分解半衰期，发 出波长为出波长为470nm470nm的持续性光，在的持续性光，在15min15min

11、时其强度时其强度 达到高峰，达到高峰，151560min60min内光强度保持相对稳定内光强度保持相对稳定(wndng)(wndng)。 光光AP /OH HPO4 2O OOCH3O- 1.3 AMPPD 1.3 AMPPD第十页，共27页。4-MUP4-MUP 4-MUP 4-MUP被被APAP催化生成催化生成4-4-甲基伞形酮，在甲基伞形酮，在360nm360nm的的 激发激发(jf)(jf)光的作用下，发出光的作用下，发出448nm448nm的荧光，可用荧的荧光，可用荧 光光度计进行测量。光光度计进行测量。荧荧光光(ynggung)AP 1.4 4-MUP 1.4 4-MUP4-MU4

12、-MU360nm360nm激发激发(jf)(jf)光光H H3 3POPO4 4 + +第十一页，共27页。2.2.直接直接(zhji)(zhji)化学发光剂化学发光剂特点：不需催化剂，只需改变溶液的特点：不需催化剂，只需改变溶液的pHpH等条件等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与信比高，发光量与AEAE浓度浓度(nngd)(nngd)呈线性关系。呈线性关系。 常用试剂：吖啶酯（常用试剂：吖啶酯（acridiniumacridinium，AEAE）+ CO+ CO2 2+ + 光光NCH3COORHO+2-NCH3C OORONCH3C

13、 OOO第十二页，共27页。3.3.电化学发光电化学发光(f un)(f un)剂剂 是指通过在电极表面进行是指通过在电极表面进行(jnxng)(jnxng)电化学反应电化学反应而发出而发出 光的物质。光的物质。特点：特点：反应在电极进行反应在电极进行(jnxng)(jnxng)； 电子供体为：三丙胺（电子供体为：三丙胺（TPATPA） 化学发光剂：三联毗啶钌化学发光剂：三联毗啶钌三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图分子结构图NNNNNNRuOONOO第十三页，共27页。第二节第二节 发光发光(f un)酶免疫测定酶免疫测定（CLEIA）一、原理一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一属于酶免疫测

14、定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应 发出的光在特定的仪器发出的光在特定的仪器(yq)(yq)上进行测定。上进行测定。二、技术类型二、技术类型(lixng) (lixng) 根据酶促反应底物不同可分为：根据酶促反应底物不同可分为： 1.1.荧光酶免疫测定技术荧光酶免疫测定技术 2.2.化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术 根据免疫学反应模式分根据免疫学反应模式分 1.1.双抗体夹心法和双抗原夹心法双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.3.固相抗原竞争法：固相抗原竞争法： 第十四页，共27页。荧光酶免疫测定技术荧光酶免疫测定技术(j

15、sh)反应原理图反应原理图EEEEE 洗涤洗涤(xd)弃上清弃上清EE碱性磷酸酶 标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原 4MU激发荧光E 是利用理想的酶荧光底物，生成的产物是利用理想的酶荧光底物，生成的产物(chnw)(chnw)稳稳定并有定并有 强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。第十五页，共27页。化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术(jsh)反应原理图反应原理图EEEEE 洗涤洗涤(xd)弃上清弃上清EE碱性磷酸酶 标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原AMPPDEAMPPD发光 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，是利用酶对发光底物催化作

16、用而直接发光， 通过通过(tnggu)(tnggu)光强度的测定而直接进行定量。光强度的测定而直接进行定量。第十六页，共27页。电化学发光电化学发光(f un)(f un)原理图原理图 这一过程可在电极表面周而复始地进行这一过程可在电极表面周而复始地进行(jnxng)(jnxng) 产生许多光子，使光信号增强产生许多光子，使光信号增强 激发态激发态不稳定不稳定TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)333*基态基态电极电极第十七页，共27页。1.1.抗原抗体结合反应抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶微将已包被了抗体的乳胶微 粒和待测标本加入反应杯中

17、粒和待测标本加入反应杯中(bi zhn)(bi zhn)，经温育一，经温育一定时间定时间 后后, ,再加入再加入APAP标记抗体，温育标记抗体，温育, ,形成固相包被抗形成固相包被抗 体体- -抗原抗原- -酶标抗体复合物酶标抗体复合物 技术技术(jsh)(jsh)要点要点 2.2.分离分离(fnl)(fnl)技术技术 将复合物转移到玻璃纤维上，将复合物转移到玻璃纤维上，用缓用缓 冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体- -抗抗 原原- -胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。3.3.酶促发光反应酶促发光反应 加入加入

18、4-MUP4-MUP，酶标抗体上，酶标抗体上APAP将将 4-MUP4-MUP分解，形成分解，形成4-MU4-MU，它在，它在360nm360nm激发光的照激发光的照 射下，发出射下，发出448nm448nm的荧光，经荧光仪记录，放大，的荧光，经荧光仪记录，放大， 根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量第十八页，共27页。1.1.磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒, ,与标与标 本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过 一定一定(ydng)(ydng)模式的免疫学反应后模式的免疫

19、学反应后, ,最终通过磁场将结最终通过磁场将结合合 酶标记物酶标记物ICIC和游离酶标记物进行分离的技术。和游离酶标记物进行分离的技术。 分离分离(fnl)(fnl)技术技术2.2.微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为 抗体或抗原的包被载体抗体或抗原的包被载体, , 然后用纤维然后用纤维(xinwi)(xinwi)膜柱子膜柱子进进 行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。3.3.包被珠分离法：包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠用聚苯乙稀等材料制成小珠, ,在在 小珠上包被抗原或抗体小珠上包被抗原或抗体, ,经抗

20、原抗体反应后经抗原抗体反应后, ,将将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离结合状态和游离状态的酶标记物进行分离. . 第十九页，共27页。第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(jsh)（CLIA）一、原理一、原理 用化学发光剂直接标记抗原或抗体用化学发光剂直接标记抗原或抗体, ,与与 待测标本中相应待测标本中相应AbAb或或AgAg、磁颗粒性的、磁颗粒性的AgAg或或AbAb反反 应，通过磁场把结合状态（沉淀部分应，通过磁场把结合状态（沉淀部分(b fen)(b fen)）和）和游离游离 状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入 发光

21、促进剂进行发光反应，通过对发光强度的发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的 检测进行定量或定性检测检测进行定量或定性检测 。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术同酶发光免疫测定技术 3.3.不同只是相应标记物是吖啶不同只是相应标记物是吖啶( dn)( dn)酯而不是酶酯而不是酶 第二十页，共27页。1.1.抗原抗体抗原抗体(kngt)(kngt)结合反应结合反应 将包被将包被McAbMcAb的磁颗粒的磁颗粒和待和待 测标本加入到反应管中，标本中待测测标本加入到反应管中，标本中待测A

22、gAg与磁珠与磁珠 上上AbAb结合，再加上结合，再加上AEAE标记标记AbAb，经过温育，形成，经过温育，形成 磁珠磁珠Ab-Ag-AEAb-Ag-AE标记标记AbAb复合物。复合物。 技术技术(jsh)(jsh)要点要点 2.2.分离技术分离技术(jsh) (jsh) 在电磁场中进行在电磁场中进行2-32-3次洗涤后，次洗涤后，很快很快 地将未结合的多余地将未结合的多余AgAg和标记和标记AbAb洗去。洗去。3.3.化学发光反应化学发光反应 经洗涤的磁经洗涤的磁珠珠中，加入中，加入H H2 2O O2 2和和 pHpH纠正液纠正液NaOHNaOH，这时，这时AEAE不需要催化剂即分解并不需

23、要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录录1 1S S内所产生的光子能，其积分与被测物含量内所产生的光子能，其积分与被测物含量 成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。 第二十一页，共27页。 1.AE 1.AE其低背景其低背景(bijng)(bijng)噪音、化学反应简单、快噪音、化学反应简单、快速而无催速而无催 化剂。化剂。方法方法(fngf)(fngf)评价评价 2.AE2.AE与大分子的结合并无减少与大分子的结合并无减少(jinsho)(jinsho)所产生的所产生的光量，光量

24、， 从而增加灵敏度，灵敏度可达从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml10-15g/ml。3.AE3.AE标记试剂有效期长，可达一年。标记试剂有效期长，可达一年。4.4.固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被 面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更 简易、快捷。简易、快捷。第二十二页，共27页。第四节第四节 电化学发光电化学发光(f un)免疫测定技术免疫测定技术（ECLI）一、原理一、原理 是一种在电极表面由电化学引发的特是一种在电极表面由电化学引发的特 异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化异性化学发光反应，

25、实际上包括了电化学和化 学发光二个过程。学发光二个过程。ECLECL是电启动发光反应，而是电启动发光反应，而CLCL 是通过化合物混合是通过化合物混合(hnh)(hnh)启动发光反应。用化学发启动发光反应。用化学发光光 剂三联吡啶钌剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+标记标记AbAb，通过，通过Ag-AbAg-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极 上发出的光强度对待测的上发出的光强度对待测的AgAg或或AbAb进行定量进行定量/ /定性。定性。二、技术类型二、技术类型 1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技

26、术 2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 同酶发光同酶发光(f un)(f un)免疫测定技免疫测定技术术 3.3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶相应标记物是三联吡啶钌而不是酶 第二十三页，共27页。 1. 1.三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本 同时加入一个反应同时加入一个反应(fnyng)(fnyng)杯中孵育反应杯中孵育反应(fnyng) (fnyng) 技术技术(jsh)(jsh)要点要点 2. 2.将链霉亲和素（将链霉亲和素（SASA）包被磁珠加入反应杯中，再次）包被磁珠加入反应杯中，再次 孵育孵育(f y)(f y)，使生物素（，使生物素（B B）通过与亲和素（）通过与亲和素（A A）的结）的结合，合， 将磁珠、将磁珠、AbAb连接为一体，形成双连接为一体，形成双AbAb夹心法。夹心法。 3. 3.蠕动泵将形成的蠕动泵将形成的 Ru(bpy)Ru(bpy)3