酱油中霉菌酵母菌计数检测(二)

1、酱油中霉菌和酵母菌酱油中霉菌和酵母菌计数检测计数检测(二二) 回忆：回忆：1、什么是霉菌？霉菌易在什么环境下生长？、什么是霉菌？霉菌易在什么环境下生长？2、酵母菌的菌落有哪些特点？、酵母菌的菌落有哪些特点？霉菌：霉菌： 霉菌霉菌是在培养基上长成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状的真菌真菌。 霉菌喜好在相对温度较低，湿度较高的环境中生长。酵母菌：酵母菌： 酵母菌属于真菌，单细胞个体较大，菌落成圆形，边缘光滑，菌落个体与细菌菌落形状类似但个头较大。工作任务第一大组任务一：第一大组任务一：马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备第二大组任务二：第二大组任务二：无菌间梯度稀释和接种操作无菌间梯度

2、稀释和接种操作交换任务分两小组完成任务，每组制备分两小组完成任务，每组制备500mL马铃薯马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，葡萄糖琼脂培养基，分装包扎后放入框内，灭菌。分装包扎后放入框内，灭菌。分两小组完成任务，轮流进入无菌间，分两小组完成任务，轮流进入无菌间，进行样品的梯度稀释和接种工作。进行样品的梯度稀释和接种工作。无菌间外等候的小组进行培养基无菌间外等候的小组进行培养基预热和仪器设备准备。预热和仪器设备准备。实训目的1、掌握霉菌酵母菌梯度稀释和接种操作手法2、能够区分霉菌酵母菌与细菌总数梯度稀释 和接种方法差异3、掌握霉菌酵母菌计数检测中梯度稀释和倾 注法接种中的无菌操作要点仪器和设备 吸量管吸

3、量管1mL 4支，支，25mL1支，带有支，带有225mL无无菌水的三角瓶菌水的三角瓶1只，带有只，带有9mL无菌水的试管无菌水的试管3只，吸耳球，酒精灯，记号笔，样品原液。只，吸耳球，酒精灯，记号笔，样品原液。 预热到预热到45度左右的马铃薯度左右的马铃薯-葡萄糖葡萄糖-琼脂培养琼脂培养基，培养皿基，培养皿4个，电炉或电热套。个，电炉或电热套。 培养箱。培养箱。 任务一：培养基制备 马铃薯马铃薯-葡萄糖葡萄糖-琼脂培养基制备琼脂培养基制备配方：配方：马铃薯（去皮切块）马铃薯（去皮切块） 150g葡萄糖葡萄糖 10.0g琼脂琼脂 10.0g氯霉素氯霉素 0.05g蒸馏水蒸馏水 500mL制法：

4、制法：将马铃薯去皮切块，加将马铃薯去皮切块，加500mL蒸馏水煮沸蒸馏水煮沸10-20min。用纱布过。用纱布过滤，补加蒸馏水至滤，补加蒸馏水至500mL。加入葡萄糖和琼脂，加热熔化，分装后，加入葡萄糖和琼脂，加热熔化，分装后，121度灭菌度灭菌20分钟。分钟。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。任务二：梯度稀释和接种梯度稀释和倾注法接种：梯度稀释和倾注法接种：1、吸取吸取25mL液体样品或称取液体样品或称取25g固体样品，无菌操作固体样品，无菌操作法加入法加入225mL无菌水中，摇匀制备成无菌水中，摇匀制备成1：10样品溶液。样品溶液。

5、 用用1mL无菌吸量管吸取无菌吸量管吸取1：10样品溶液，用无菌方样品溶液，用无菌方法各取法各取1mL，分别加入到，分别加入到2个无菌培养皿中。个无菌培养皿中。2、换一只无菌吸量管换一只无菌吸量管吸取吸取1mL1：10样品溶液，加入样品溶液，加入到装有到装有9mL无菌试管中无菌试管中反复吹吸，反复吹吸，制备成制备成1：100样样品溶液。品溶液。用这支吸量管各取用这支吸量管各取1mL1：100溶液，加入溶液，加入到到2个培养皿中。个培养皿中。3、再、再换一只无菌吸量管换一只无菌吸量管吸取吸取1mL1：100样品溶液，样品溶液，加入到装有加入到装有9mL无菌试管中无菌试管中反复吹吸，反复吹吸，制备

6、成制备成1：1000样品溶液。样品溶液。用这支吸量管各取用这支吸量管各取1mL1：1000溶液，加入到溶液，加入到2个培养皿中。个培养皿中。4、再换一只无菌吸量管，吸取、再换一只无菌吸量管，吸取1mL空白溶液，加空白溶液，加入到无菌培养皿中。入到无菌培养皿中。5、将预热到、将预热到45度左右的马铃薯度左右的马铃薯-葡萄糖葡萄糖-琼脂培养琼脂培养基加入基加入15-20mL到装有到装有1：10、1：100、1：1000和空白的培养皿中，混匀冷却，倒置培养和空白的培养皿中，混匀冷却，倒置培养28度，度，5天后观察。天后观察。 1、样品的稀释 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水

7、的锥形瓶中，充分振摇，即为 1:10充分稀释液。 或放入盛有225ml 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 取1ml1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中， 另换一只1ml无菌吸管反复吹吸，此液为1：100稀释液。 按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管 2、接种 根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀

8、释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。 及时将 15ml20ml 冷却至 46的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。国家标准介绍 目前使用标准：目前使用标准：中华人民共和国国家标准 GB4789.152010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 适用范围：适用范围：本标准规定了食品中霉菌和酵母菌 的计数方法。 本标准适用与各类食品中霉菌和酵母的计数。 检测流程 检样25g（ml）样品+ 225ml无菌蒸馏水，均质10倍系列稀释选择2个3个适

9、宜稀释度的样品匀液，各取 1ml 分别加入无菌培养皿内每皿中加入15ml20ml 马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基菌落计数 报告操作步骤1、 样品的稀释固体和半固体样品：固体和半固体样品： 称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为 1:10充分稀释液。或放入盛有225ml 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。液体样品：液体样品： 以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。取1ml1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中， 另换一只1ml无

10、菌吸管反复吹吸，此液为1：100稀释液。按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管。2、接种 根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。 及时将 15ml20ml 冷却至 46的马铃薯马铃薯葡萄葡萄糖糖琼脂或孟加拉红培养基琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。3、培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。4、 菌落计数

11、 肉眼观察必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 5、结果与报告结果计数： 计计算两个平板菌落数的平均数，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多 不可计，结果按平均落数乘以最高稀释倍数计算。报告： 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 菌落术大于或等于100时，前3位数字采用两位有效数字，后面用0代替位数来表示结果：也可以10的指数来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/g为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母菌。附表： 孟加拉红培养基孟加拉红培养基配方：配方：蛋白胨蛋白胨 5.0g 葡萄糖葡萄糖 10.0g磷酸二氢钾磷酸二氢钾 1.0g 硫酸镁（无水）硫酸镁（无水） 0.5g琼脂琼脂 20.0g 孟加拉红孟加拉红 0.033g氯霉素氯霉素 0.1g 蒸馏水蒸馏水 1000mL制法：制法：将上述成分加入蒸馏水中，加热熔化，补足蒸馏水至将上述成分加入蒸馏水中，加热熔化，补足蒸馏水至1000mL，