第五章器官培养

1、第五章第五章 器官培养器官培养叶的培养根的培养茎尖、茎段的培养花药的培养一、概念：一、概念：J植物离体组织（器官）的快速繁殖植物离体组织（器官）的快速繁殖（in vitro tissue or organ rapid propa-gationin vitro tissue or organ rapid propa-gation ） 是指利用植物组织培养技术，通过无菌操作，将植物是指利用植物组织培养技术，通过无菌操作，将植物离体组织（器官）（离体组织（器官）（in vitro tissue or organ in vitro tissue or organ ）接种在）接种在人工控制的营养和环境条

2、件下进行培养，使其再生成人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其再生成完整的植株而进行的快速繁殖方法。完整的植株而进行的快速繁殖方法。J离体繁殖离体繁殖（in vitro propagationin vitro propagation）J微繁殖微繁殖（MicropropagationMicropropagation）J离体营养繁殖离体营养繁殖（in vitro vegetative propagation in vitro vegetative propagation ）J离体无性（系）繁殖离体无性（系）繁殖（in vitro asexual propagation in vitro asex

3、ual propagation ）第一节第一节 概概 述述二、器官培养的优点二、器官培养的优点F小型高效F可实行工厂化生产F加速繁育优良品种一般选育一个新品种，用传统方法需810年，用微繁殖方法只需2年左右的时间。F保持优良品种的特性F体细胞无性系变异材是育种好资源F有利于物质保存三、离体快速繁殖发展情况三、离体快速繁殖发展情况F 19521952年年MorelMorel和和MartinMartin首次证实通过茎尖组织离体培养，可以从已受病毒浸染首次证实通过茎尖组织离体培养，可以从已受病毒浸染的大丽花中获得无毒植株。的大丽花中获得无毒植株。F 19571957年年SkoogSkoog和和Mil

4、lerMiller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数F 19581958年年WicksonWickson和和ThimannThimann指出，利用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情指出，利用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。况下处于休眠状态的腋芽的生长。F 19581958年德国年德国ReinertReinert和美国和美国StewardSteward分别报道在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体分别

5、报道在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚细胞胚(somatic embryo)(somatic embryo)。F 19621962年，年，MurashigeMurashige和和SkoogSkoog开发了化学成分完备的适于烟草愈伤组织快速繁开发了化学成分完备的适于烟草愈伤组织快速繁殖的改良培养基（殖的改良培养基（Murashige and SkoogMurashige and Skoog Medium Medium，MSMS培养基）培养基）F 19601960年年MorelMorel发现对兰花（发现对兰花（CymbidiumCymbidium）的离体茎尖进行培养时，茎尖形成）的离体茎尖进行培

6、养时，茎尖形成扁球状的原球茎，他们在形态上与种子萌发时由胚形成的原球茎相似。扁球状的原球茎，他们在形态上与种子萌发时由胚形成的原球茎相似。F 据不完全统计，全世界进行快速繁殖研究的植物已有据不完全统计，全世界进行快速繁殖研究的植物已有130130属属10001000种种，其中最主，其中最主要的是要的是，约，约8080属，属，450450种。但是用工厂化的大规模生产主要有种。但是用工厂化的大规模生产主要有花卉（如蔷薇属、菊属、石竹属、兰属），果树（如桃、柑橘、苹果、香蕉、花卉（如蔷薇属、菊属、石竹属、兰属），果树（如桃、柑橘、苹果、香蕉、甘蔗、草莓），蔬菜作物（如马铃薯、大蒜），树木（如桉树），

7、珍稀植物甘蔗、草莓），蔬菜作物（如马铃薯、大蒜），树木（如桉树），珍稀植物（如安徽黄里子石榴、太和樱桃）等。（如安徽黄里子石榴、太和樱桃）等。四、应用的前景四、应用的前景1 1、用来加速繁殖、用来加速繁殖用种子繁殖较用种子繁殖较难的植物或繁殖速度较慢的植难的植物或繁殖速度较慢的植物物，如一些名贵花卉（兰花、，如一些名贵花卉（兰花、君子兰等）。君子兰等）。2 2、加速繁殖、加速繁殖珍稀濒危植物珍稀濒危植物红花木莲 3 3、利用脱毒技术繁殖主要靠营养繁殖的一些、利用脱毒技术繁殖主要靠营养繁殖的一些易易感病毒感病毒的花卉、作物、果树等（如香石竹、百的花卉、作物、果树等（如香石竹、百合、草莓、马铃薯）

8、。合、草莓、马铃薯）。4 4、一些、一些基因型杂合的园艺作物基因型杂合的园艺作物，如非洲菊、花，如非洲菊、花烛等，没有很好的常规营养繁殖方法，而种子烛等，没有很好的常规营养繁殖方法，而种子繁殖因基因重组会导致性状的变异，丧失一些繁殖因基因重组会导致性状的变异，丧失一些优良性状。优良性状。5 5、用于需要加速繁殖的、用于需要加速繁殖的特殊基因型特殊基因型。新品种；国外引入的少量植物材料；新品种；国外引入的少量植物材料；果树中的优良芽变品种和木本植物的优选单株；果树中的优良芽变品种和木本植物的优选单株；雌雄异株的植物中有良好经济性状的加速繁殖。雌雄异株的植物中有良好经济性状的加速繁殖。一、离体根的

9、培养一、离体根的培养 第一节第一节 根的培养根的培养 （一）（一）意义：是进行根系生理代谢研究的最优实验体系。研究器官分化、形态建成的良好体系。建立快速生长的根无性系。对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体。 （二）（二）培养方法： 一般方法： 无菌种子萌发-根离体培养（多采用液体培养）-侧根-扩大繁殖。 （三）培养基（三）培养基 低盐培养基：低盐培养基：WHITEWHITE，其它培养基，其它培养基2/3MS2/3MS，1/2MS1/2MS，B B5 5 激素：研究较多的是研究较多的是生长素生长素。影响可以分以下几种情况：。影响可以分以下几种情况：抑制离体根生长：如樱桃、番茄、红花槭。抑制离

10、体根生长：如樱桃、番茄、红花槭。促进离体根生长：欧洲赤松、白羽扇豆、矮豌豆、玉米、小促进离体根生长：欧洲赤松、白羽扇豆、矮豌豆、玉米、小麦。麦。 生长依赖于生长素：黑麦、小麦的一些变种。生长依赖于生长素：黑麦、小麦的一些变种。 激动素则能增加根分生组织的活性，有抗老化的作用。激动素则能增加根分生组织的活性，有抗老化的作用。（四）影响离体根因素：（四）影响离体根因素： 1 1基因型基因型 无限继代生长：番茄、烟草、马铃薯、小麦无限继代生长：番茄、烟草、马铃薯、小麦 有限继代生长：胡萝卜、向日葵、豌豆、荞麦有限继代生长：胡萝卜、向日葵、豌豆、荞麦 2 2营养条件：营养条件：离体根培养可利用唯一氮源

11、。离体根培养可利用唯一氮源。 VB1VB1是番茄离体培养不可缺少的。适宜的浓度范围内，对生长是番茄离体培养不可缺少的。适宜的浓度范围内，对生长的促进作用与浓度成正比。的促进作用与浓度成正比。一、概念和意义一、概念和意义 第二节第二节 茎尖的培养茎尖的培养2 2、概念、概念J茎尖分生组织培养：茎尖分生组织培养：主要是指对茎尖长度不超过主要是指对茎尖长度不超过0.lmm0.lmm的茎的茎尖进行培养，这种培养可获得无病毒植株。最大直径为尖进行培养，这种培养可获得无病毒植株。最大直径为100100微微米，最大长度为米，最大长度为250250微米，最小的只有几十微米。微米，最小的只有几十微米。 J普通茎

12、尖培养：普通茎尖培养：是指对是指对几毫米乃至几十毫米几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。及侧芽的培养。1、分类、分类茎尖培养茎尖培养根据培养目标和取材大小根据培养目标和取材大小茎尖分生组织培养茎尖分生组织培养普通茎尖培养普通茎尖培养二、茎尖培养的准备工作二、茎尖培养的准备工作（一）外植体材料的准备（一）外植体材料的准备1 1、外植体材料的选择、外植体材料的选择J植物的种类：植物的种类：一般来说，木本植物茎尖再生能力比草本植物相对差一点，增殖率一般来说，木本植物茎尖再生能力比草本植物相对差一点，增殖率低一点；双子叶植物通常比单子叶植物容易获得再生植株，而裸子植物则相当有限

13、（除低一点；双子叶植物通常比单子叶植物容易获得再生植株，而裸子植物则相当有限（除非在幼龄阶段）。非在幼龄阶段）。 J植物的年龄、生理状态和取材部位：植物的年龄、生理状态和取材部位：J选用幼龄植株选用幼龄植株 J一般认为，处于植物一般认为，处于植物营养生长状态营养生长状态的外植体比生殖生长时具有更的外植体比生殖生长时具有更强的再生能力（除少数例外）。强的再生能力（除少数例外）。 J在对根状茎植物如草莓进行微繁时，通常是使用匍匐枝的茎尖。在对根状茎植物如草莓进行微繁时，通常是使用匍匐枝的茎尖。对胡椒茎尖培养，只能采取茎的顶芽的茎尖进行培养，才能保持对胡椒茎尖培养，只能采取茎的顶芽的茎尖进行培养，才

14、能保持其特性。其特性。 J取材季节：取材季节：生长季节时取样。生长季节时取样。J取材大小：取材大小：茎尖越小，成活率越低。生产上常采用茎尖越小，成活率越低。生产上常采用5 510mm10mm ，脱毒小于，脱毒小于1mm1mm2 2、外植体材料的灭菌外植体材料的灭菌（1 1）预处理）预处理材料修整、自来水冲洗、材料修整、自来水冲洗、 洗涤剂刷洗（可加数洗涤剂刷洗（可加数滴滴0.080.080.12%0.12%吐温（吐温（TweenTween）2020或或8080增溶剂）增溶剂）（2 2）选择消毒剂：）选择消毒剂：见下页见下页（3 3）具体操作技术：）具体操作技术：常规的消毒方法常规的消毒方法70

15、%70%酒精，数秒至酒精，数秒至3030秒秒 2 210%NaClO10%NaClO溶液，溶液，10103030分钟；或者分钟；或者0.1%0.1%汞液汞液消毒消毒5 515 15 分钟分钟数滴数滴0.080.080.12%0.12%吐温吐温2020或或8 8无菌水冲洗无菌水冲洗3 35 5次次消毒剂使用浓度 % 清除难易消毒时间 min灭菌效果次氯酸钠次氯酸钙漂白粉升汞酒精过氧化氢溴水硝酸银抗菌素2910饱和溶液0.1170751012121450mgL-1易易易较难易最易易较难中5305305302100.225152105303060很好很好很好最好好好很好好较好（二）培养基的准备（二）

16、培养基的准备1. 1.选择培养基选择培养基（1 1）植物材料基因型的专一性）植物材料基因型的专一性（2 2）培养基的总离子浓度（）培养基的总离子浓度（Total ionic stregthTotal ionic stregth）（3 3）培养基的总氮水平、苗芽培养中的钙缺乏和氯化）培养基的总氮水平、苗芽培养中的钙缺乏和氯化物敏感性等物敏感性等2.2.选择培养基的方法：选择培养基的方法：“广谱实验广谱实验”等。等。3.3.培养基的灭菌培养基的灭菌（1 1）高压蒸汽灭菌、）高压蒸汽灭菌、（2）过滤灭菌）过滤灭菌0.45m（三）接种工具、用具、接种室的（三）接种工具、用具、接种室的准备准备1. 1.

17、接种工具、用具、的准备及灭菌接种工具、用具、的准备及灭菌高温高压蒸汽灭菌锅灭菌、时间高温高压蒸汽灭菌锅灭菌、时间3030分钟分钟 2.2.接种室的灭菌接种室的灭菌甲醛熏蒸法灭菌（按甲醛熏蒸法灭菌（按3 3份甲醛：份甲醛：1 1份高锰酸钾）份高锰酸钾）用用2 2新洁尔灭液或新洁尔灭液或7070酒精擦洗室内墙壁、地酒精擦洗室内墙壁、地板及设备。板及设备。接种前，提前接种前，提前1 1小时，开紫外线灯消毒小时，开紫外线灯消毒20203030分分钟。钟。 三、茎尖培养的程序和技术三、茎尖培养的程序和技术1 1、初代培养：、初代培养：是指将外植体接种到培养基上，经培养形成芽，或脱分化形成是指将外植体接种

18、到培养基上，经培养形成芽，或脱分化形成愈伤组织的过程。愈伤组织的过程。 2 2、继代培养：、继代培养：外植体接种后，一般经培养外植体接种后，一般经培养30304040天后，将外植体转接种到新的培养天后，将外植体转接种到新的培养基里进行培养，促进其分化增殖，以获得更多的芽苗。增殖培养基里进行培养，促进其分化增殖，以获得更多的芽苗。增殖培养3 3、生根壮苗培养：、生根壮苗培养： 试管内生根试管内生根（in vitro rootingin vitro rooting）：指继代培养产生的芽苗、嫩梢，当增殖）：指继代培养产生的芽苗、嫩梢，当增殖到一定数量并长出叶片时，将伸长的芽苗、嫩梢从基部切割分离开并

19、转接入到一定数量并长出叶片时，将伸长的芽苗、嫩梢从基部切割分离开并转接入生根培养基培养，促进其生根。生根培养基培养，促进其生根。 试管外生根：试管外生根：是指将试管内繁殖的嫩枝当作微型插条，直接插入基质，让插是指将试管内繁殖的嫩枝当作微型插条，直接插入基质，让插条生根驯化（条生根驯化（habituationhabituation）。）。4 4、炼苗与移栽、炼苗与移栽J 炼苗：炼苗：为了提高植株的适应能力，提高移栽的成活率，生产上，必须尽可为了提高植株的适应能力，提高移栽的成活率，生产上，必须尽可能地创造一个适宜于试管苗过渡、锻炼和适应的过程，这一工作叫驯化或能地创造一个适宜于试管苗过渡、锻炼和

20、适应的过程，这一工作叫驯化或炼苗（炼苗（AcclimationAcclimation）。）。J 试管苗移栽：试管苗移栽：把完整的再生植株移至大田种植这一过程。把完整的再生植株移至大田种植这一过程。 滤滤纸纸桥桥瓶瓶外外 生生根根四、影响茎尖培养微繁殖的因素四、影响茎尖培养微繁殖的因素 1 1基因型基因型 2 2外值体的大小外值体的大小 3 3供试植株的生理状态供试植株的生理状态 4 4芽在植株上的部位芽在植株上的部位 5 5供试植株的年龄供试植株的年龄 6. 6. 培养基培养基 7. 7. 褐变褐变8. 8. 玻璃化玻璃化 9. 9. 极性极性1010后生变化后生变化 1111中间繁殖体的形态

21、发生能力中间繁殖体的形态发生能力 1212遗传稳定性遗传稳定性 第三节第三节 茎段培养茎段培养一、概念和意义一、概念和意义1 1、概念：、概念：茎段培养是指对去除茎尖后带有侧芽（腋芽）或叶柄、长约茎段培养是指对去除茎尖后带有侧芽（腋芽）或叶柄、长约2 23 3厘米厘米的茎段的离体培养。的茎段的离体培养。2 2、意义：、意义：外植体来源广、技术简单、操作方便、成活率高，成苗时间短。外植体来源广、技术简单、操作方便、成活率高，成苗时间短。茎段培养，其表现型和母株的基因型一致，遗传性稳定。茎段培养，其表现型和母株的基因型一致，遗传性稳定。茎段培养同茎尖分生组织脱毒培养结合起来，可以有效地解决脱毒苗的

22、快速繁茎段培养同茎尖分生组织脱毒培养结合起来，可以有效地解决脱毒苗的快速繁殖题。殖题。茎段培养若通过诱导愈伤组织途径进行快繁，往往会发生突变，其中一些有利茎段培养若通过诱导愈伤组织途径进行快繁，往往会发生突变，其中一些有利突变是育种的材料。突变是育种的材料。利用茎段培养，可以研究植物的器官分化、形态建成、器官功能和种质保存问利用茎段培养，可以研究植物的器官分化、形态建成、器官功能和种质保存问题。题。二、茎段培养的程序二、茎段培养的程序初代培养初代培养继代培养继代培养生根壮苗生根壮苗试管苗移栽试管苗移栽 第四节第四节 叶的培养叶的培养概念：概念： 离体叶培养离体叶培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、

23、叶片、子叶等叶组织是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。的无菌培养。意义。意义。 1 1、它是研究叶形态建成，光合作用，叶绿素形成等理论问题的良好方法、它是研究叶形态建成，光合作用，叶绿素形成等理论问题的良好方法 2 2、通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。、通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。 3 3、通过离体叶组织、细胞的培养、探索离体叶组织、细胞培养的条件和、通过离体叶组织、细胞的培养、探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素，为叶片原生质体培养和原生质体融合研究提供理论依据。影响因素，为叶片原生质体培养和原生质体融合研究提供理

24、论依据。 4 4、利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高、利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。某些不易繁殖植物的繁殖系数。 5 5、叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处、叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体而应用于育种实践。理可筛选出突变体而应用于育种实践。 二、叶片组织的脱分化和再分化培养二、叶片组织的脱分化和再分化培养 一、叶原基培养一、叶原基培养 采用采用休眠期的顶芽休眠期的顶芽，剥去一部分鳞片后，在，剥去一部分鳞片后，在5 5次氯酸钠溶次氯酸钠溶液中

25、浸泡液中浸泡 20min20min，进行表面消毒。，进行表面消毒。 切取柱状叶原基进行培养。切取柱状叶原基进行培养。 培养基采用培养基采用KonpsKonps无机盐（部分修改）或无机盐（部分修改）或KundsonKundson（19511951）配方，添加配方，添加NitschNitsch配方中的微量元素和配方中的微量元素和2 2蔗糖、蔗糖、8%8%琼脂。琼脂。pH5.5pH5.5。 部分实验中添加维生素、水解酪蛋白等。部分实验中添加维生素、水解酪蛋白等。 温度为温度为2424，人工光照，人工光照24h24h。 一、叶原基培养一、叶原基培养 （一）叶组织培养的一般方法（一）叶组织培养的一般方法

26、 1 1叶组织分离与消毒叶组织分离与消毒 用幼嫩叶片进行培养时，选取顶端未充分展开的幼嫩叶片。用幼嫩叶片进行培养时，选取顶端未充分展开的幼嫩叶片。经流水冲洗后，用蘸有少量经流水冲洗后，用蘸有少量7575乙醇的纱布擦拭叶片表面，乙醇的纱布擦拭叶片表面，0.10.1升汞溶液中消毒升汞溶液中消毒5 58min8min，再用无菌水冲洗，再用无菌水冲洗3 34 4次。次。消毒后的叶片转入到铺有无菌滤纸的培养皿内。切成消毒后的叶片转入到铺有无菌滤纸的培养皿内。切成5x5mm5x5mm左右左右的小块，然后上表皮朝上接在固体培养基上培养。的小块，然后上表皮朝上接在固体培养基上培养。 二、叶片组织的脱分化和再分

27、化培养二、叶片组织的脱分化和再分化培养 2 2培养基培养基 常用：常用：MSMS、WhiteWhite、N N6 6等培养基。等培养基。蔗糖，浓度为蔗糖，浓度为3 3左右。培养基中附加椰子汁等有机添加物，有左右。培养基中附加椰子汁等有机添加物，有利于叶片组织培养中的形态发生。利于叶片组织培养中的形态发生。激素是影响烟草叶组织脱分化和再分化的主要因素。激素是影响烟草叶组织脱分化和再分化的主要因素。 对大多数双子叶植物来讲细胞分裂素，特别是对大多数双子叶植物来讲细胞分裂素，特别是KTKT和和6-BA6-BA有利有利于芽的形成；于芽的形成；生长素，特别是生长素，特别是NAANAA则抑制芽的形成而有利

28、于根的发生。则抑制芽的形成而有利于根的发生。2 2，4-D4-D是一种强生长剂，有利于愈伤组织的形成。是一种强生长剂，有利于愈伤组织的形成。 3 3培养条件培养条件 25252828，光照，光照121214h14h，光照度约为，光照度约为150015002000lx2000lx。 不定芽分化和生长期应增加光照度到不定芽分化和生长期应增加光照度到300030005000lx5000lx。 4供试植株的发育时间和叶龄 （二）影响叶组织培养的因素（二）影响叶组织培养的因素 1 1基因型基因型 2 2细胞分裂素细胞分裂素 两种细胞分裂素对芽的分化影响，两种细胞分裂素对芽的分化影响，6-BA6-BA的作

29、用好于的作用好于KTKT的作用。但的作用。但6-BA6-BA对不定芽的进一步发育即茎叶的形成有抑制作用。对不定芽的进一步发育即茎叶的形成有抑制作用。 3 3细胞分裂素与生长素的组合细胞分裂素与生长素的组合 6. 极性 研究表明，烟草成株期，叶组织脱分化和再分化需要的时间较长。而且叶片膨大体积较大，多在刀口处形成大量的愈伤组织和分生细胞团，芽苗大多发生在这些细胞分生团和结构致密的愈伤组织上。幼叶可以直接从不同部位成苗。 个体发有早期的幼嫩叶片较成熟期幼嫩叶片分化能力高。 离体叶片本身的位置对分化也影响很大。同一株烟草不同叶位叶片对器官分化的影响不同，发育完全的叶片，叶组织器官分化能力较发育幼龄叶片组织再分化能力低得多在离体叶片再生中，叶脉的作用也是明显的。