ChgODN的免疫刺激作用实用教案

1、CPG概念(ginin)为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列，即CpG 基序。一种免疫佐剂作用(zuyng)靶点TLR9细胞免疫，体液免疫第1页/共32页第一页，共33页。Th1免疫(miny)应答 慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下(dxi)(dxi) HBVHBV免疫耐受，持续感染 肿瘤微小残留病的清除第2页/共32页第二页，共33页。CPG提高(t go)PBMC中Th1细胞第3页/共32页第三页，共33页。Th1Th1占淋巴细胞百分比第4页/共32页第四页，共33页。CPG提高(t go)PBMC中Th1 、Tc1细胞百分率*：与对照组比较(bjio)， 第5页/共32页第五页，共33页

2、。CPG刺激(cj)BPMC分泌细胞因子*：与对照组比较(bjio)， 第6页/共32页第六页，共33页。CPG诱导(yudo)PBMC杀伤靶细胞n收集CPG活化的PBMCn细胞(xbo)毒性实验：效应细胞(xbo)为CPG活化的PBMC；靶细胞(xbo)为CFSE预染的K562细胞(xbo)。对照组效应细胞(xbo)为未经CPG活化的PBMC。n效：靶20：1，混合培养2h。流式细胞(xbo)术检测靶细胞(xbo)死亡率。第7页/共32页第七页，共33页。CPG诱导(yudo)PBMC杀伤靶细胞第8页/共32页第八页，共33页。CFSE染色(rns)靶细胞n浓度为5mol/ L 的CFSE

3、（2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液n取对数生长期的靶细胞(xbo)浓度108/ Ln细胞(xbo)悬液与等体积CFSE 工作液混合n37 孵育10 min。n离心洗涤两次后n悬浮细胞(xbo)备用第9页/共32页第九页，共33页。CFSE染色(rns)靶细胞第10页/共32页第十页，共33页。实验(shyn)结果 CpG活化PBMC对K562细胞(xbo)的杀伤作用(N=5)CPG活化PBMC 5.14 %对照组2.83 %*：与对照组比较(bjio)， 第11页/共32页第十一页，共33页。CIK细胞(xbo)杀伤靶细胞(xbo)第12页/共32页第十二页，共33页。CIK细胞(xb

4、o)杀伤靶细胞(xbo)第13页/共32页第十三页，共33页。研究(ynji)背景 通过主动免疫、过继特异性免疫、过继非特异性免疫等方式，清除慢性乙肝患者体内残存(cncn)(cncn)的HBVHBV，达到治疗效果。第14页/共32页第十四页，共33页。研究(ynji)背景 B淋巴细胞具有抗原递呈(d chn)细胞的性质，同时具有CpG-ODN受体：TLR-9。本研究探讨CpG-ODN诱导B淋巴细胞成为高效APC，使之具有类似于树突状细胞功能的可行性。第15页/共32页第十五页，共33页。TOLL受体第16页/共32页第十六页，共33页。TOLL受体在血细胞中的表达(biod)第17页/共32

5、页第十七页，共33页。活化B细胞负载(fzi)核心抗原n磁珠分选B淋巴细胞nCPG活化(huhu)B淋巴细胞n核心抗原肽:FLPSDFFPSV-FITCn流式细胞仪、荧光显微镜检测抗原负载状况第18页/共32页第十八页，共33页。磁珠分选B细胞(xbo)分选前B B细胞(xbo) (xbo) 7.89% 7.89% 分选后B B细胞(xbo) (xbo) 89.6% 89.6% 第19页/共32页第十九页，共33页。活化(huhu)B细胞负载抗原肽第20页/共32页第二十页，共33页。活化B细胞负载核心(hxn)抗原荧光(ynggung)显微镜观察B细胞负载HBcAg18-27肽 第21页/共

6、32页第二十一页，共33页。APC与T细胞作用(zuyng)机制第22页/共32页第二十二页，共33页。CPG对B细胞抗原递呈相关分子(fnz)的作用研究nCpG2006、2216由上海生物工程技术服务(fw)有限公司合成，全硫代化修饰n对照组为含10%FCS的RPMI1640外周血PBMC，细胞量107/孔，37、5%CO2、48小时n实验组加入CpG2006或CpG2216，终浓度均为1umol/mL，余同上第23页/共32页第二十三页，共33页。CpG提高(t go)淋巴细胞CD69表达 T T淋巴细胞 B B淋巴细胞 CD69表达率（%）*：与对照组比较(bjio)， 第24页/共32

7、页第二十四页，共33页。B细胞(xbo)CD80、CD86表达对照组加CPG-ODN组加CPG-ODN组第25页/共32页第二十五页，共33页。CpG提高B细胞(xbo)表面CD80、CD86的表达 CD80 CD80 CD86CD86CD80、CD86表达率（%）*：与对照组比较(bjio)， 第26页/共32页第二十六页，共33页。B细胞(xbo)MHC-、MHC-表达对照组加CPG-ODN组第27页/共32页第二十七页，共33页。CpG提高B细胞(xbo)表面MHC-、MHC-的表达 MHC-MHC-MHC表达量（MFI）*：与对照组比较(bjio)， 第28页/共32页第二十八页，共3

8、3页。活化(huhu)B细胞诱导CTLn负载了抗原的活化B细胞(xbo)与淋巴细胞(xbo)混合培养(含IL-2的RPMI1640培养液).n收集细胞(xbo),以五聚体技术检测HBV特异性CTL.n实验组特异性CTL为0.500.19%，对照组为0.200.10%。 第29页/共32页第二十九页，共33页。特异性CTL诱导(yudo)Pro5TM MHC Pentamers检测(jin c)对照组和实验组HBcAg18-27抗原特异性CTL（Q2-1区）。前者为对照组（未加APC），后者为实验组（加APC）。第30页/共32页第三十页，共33页。结论(jiln)nCpG能够活化(huhu)B细胞，对T细胞无明显的作用nCpG能够提高B细胞表面抗原递呈相关分子的表达nCPG诱导PBMC产生高水平的IFN-nCPG诱导淋巴细胞向Th1、Tc1分化nCPG增强PBMC对K562细胞的杀伤作用n通过B细胞介导, CPG可诱导特异性CTL第31页/共32页第三十一页，共33页。感谢您的观看(gunkn)！第32页/共32页第三十二页，共33页。NoImage内容(nirng)总结CPG概念。效：靶20：1，混合培养2h。浓度为5mol/ L 的CFSE （2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液。37 孵育10 min。