细菌DNA的提取方法

1、细菌DNA的提取方法针对一些不易于提取的细菌的方法：试验试剂：抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)(去色素)100mMTris-HCl25mMEDTA10MLiCl2MLiClDEPC-water(抑制RNA酶活性)3MNaAc96%乙醇70%乙醇试验步骤：1、抽提缓冲液65c预热。2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65C,10min。3、加酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）,振荡，以12,000rpm,离心10min。4、取上清，加氯仿/异戊醇（24:1）振荡，以12,000rpm,离心10min。5、重复再作一次步骤4。6、加入1/10体积的3M醋酸

2、钠和倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），一20C下沉淀。7、以2,000rpm,离心10min。8、弃上清，以70%乙醇条洗沉淀，也可以再用100%乙醇洗，然后溶解于100ml水中。较为常用的细菌DNA提取方法:实验步骤：1、将菌株接种于液体LB培养基，37C震荡培养过夜。2、取培养物12000rpm离心2min。3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀，于37c温育1h.4、力口入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再力口入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65C温育10mino5、加入等体积的酚/氯仿/异戊

3、醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇.真菌DNA提取总结的两种方法:第一种方法：试验步骤：1、取真菌菌丝，在液氮中迅速研磨成粉。2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋35min(此处是粗提没有加酚)。4、以4C,1000rpm,离心5min。5、上清再用等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提一次。以4C,10,000rpm,离心5min。6、取上清，加入2/3倍体积的-20C预冷的异丙醇或倍体积的无水乙醇沉淀，混匀,静置约3

4、0min。7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中。8、力口入1ulRNaseA(10mg/mL),37c下处理1h。9、用酚()：氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4C,10,000rpm,离心5min。10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,倍体积的无水乙醇，-70C沉淀30min以上。11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，-20°C保存备用。DNA提取液：1%SDG3MNaAc。第二种方法：试验步骤：1、真菌菌丝，在液氮中迅速研磨成粉。2、加入3mL65

5、c预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65c水浴30min,期间混匀2-3次。3、力口入1mL5MKAc,冰浴20min。4、等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4c离心5min)。5、取上清，加入2/3倍体积的-20C预冷异丙醇，混匀，静置约30min。6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中。7、力口入1ulRNaseA(10mg/mL),37c处理1ho8、用酚()：氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4C,10,000rpm,离心5min。9、取上清，1/10V3

6、MNaAc,体积的无水乙醇,-70°C沉淀30min以上。10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，-20°C保存备用。细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。1快速微量提取法A.取菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠，1mMEDTA,1%SDS)混匀，置于37oC水浴1hr。C然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾（

7、3M,-20度保存1小时后，13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50U1TE溶液中，置4c保存备用。2蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体，用WashingTE（50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml1XTEg冲液中，先后加入5mg/L的蛋白酶、10%SDS轻轻混匀后50c放置3h5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸

8、管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1XT豉ddH2O中。31）细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37c摇床（300rpm）培养过液。2）细菌收集：取1ml培养物于EP管中，室温8000rpm离心5min,弃上清，沉淀重新悬浮于1mlTE（）中（用ddH2O也行）。3）菌体裂解：加入6gl50mg/ml的溶菌酶，37c作用2h。再力口2mol/LNaCl50%110%SDS110跖120mg/ml的蛋白酶K3gl50c作用3h或37c过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4）抽提：菌液均分到两个EP管，加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24：1）,混匀，室温

9、放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5）沉淀：加倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。6）洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7）抽（凉）干后，溶于50glddHO中，取2-5"电泳。作PCR模板用。4. DNAEXTRACTIONPROCEDURE-GENERAL1) Growcellsovernightin500mlbrothmedium.2) Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris(pH,50mMEDTA.3)

10、 Freezecellsuspensionat-20C4) Addml250mMTris(pH,10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtemperature.Whenthawed,placeonicefor45min.5) Add1ml%SDS,50mMTris(pH,MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbathfor60min.6) Extractwith6mlTris-equilibratedphenolandcentrifugeat10,000Xgfor15min.Transferto

11、playertonewtube(avoidinterface).Re-dothisstepifnecessary.7) Addvol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).SpooloutDNAandtransferto5ml50mMTris(pH,1mMEDTA,200g/mlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.8) Extractwithequalvolumechloroform(mixbyinverting)andcentrifugeat10,000Xgfor5min.

12、Transfertoplayertoanewtube.9) Addvol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).10) SpooloutDNAanddissolvein2ml50mMTris(pH,1mMEDTA.11) CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotometricanalysis.1）100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。2）加TE悬浮沉淀，并加10%SDS,50gl20mg/n<1mg干粉）蛋白酶K,混匀，37c保

13、温1小时。3）力口5mol/LNaCl,混匀。4）加CTAB/NaCl溶?,混匀，65c保温20分钟。5）用等体积酚：氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。6）用等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提，取上清液移至干净管中。7）加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA。8）用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干,溶解于1mlTE,-20c保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀。9）如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。注：1）CTAB/NaCl溶液：NaCl溶解于80mlH2O,缓慢加

14、入10gCTAB力口水至100ml。2）氯仿:异戊醇（24:1）,酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）,异丙醇，70%乙醇，TE,10%SDS蛋白酶K（20mg/ml或粉齐Q,5mol/LNaCl。本方法通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：仪器：同方法一二：试剂：TE、TAE缓冲10%SDS;5MNaCL;20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液（10%CTAB,NaCL溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB,加热溶解）；25/24/1,酚/氯仿/异戊醇；24/1，氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及100%乙醇三：操作对数生长期细菌细胞离心，5000rpm,1min沉淀溶于500从lTEg冲液中混匀30gl10%SDS,3ML蛋白酶K,混匀，3