生化12DNA生物合成

1、 基因信息的传递基因信息的传递基因：基因：编码生物活性产物的编码生物活性产物的DNA功能片段功能片段基因基因三大特征三大特征： 携带遗传信息携带遗传信息 能被复制能被复制 能突变能突变复制复制翻译翻译 蛋白质蛋白质（病毒）（病毒） RNA（病毒）（病毒）逆转录逆转录转录转录RNA翻译翻译蛋白质蛋白质DNA复制复制中心法则（中心法则（The central dogma）DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 12 章章复制复制(replication)指遗传物质的传代，以亲代指遗传物质的传代，以亲代DNA为为模板，模板，dNT

2、P (dATP dGTP dCTP dTTP)为原料，按碱基配对规律合成子代为原料，按碱基配对规律合成子代DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节一、半保留复制一、半保留复制 (semi-conservative replication)子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 密度梯度实验密度梯度实验 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲，即子代保留了亲代的全部遗传信息，

3、体现了遗传的代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性保守性。 半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但基础，但不是绝对的不是绝对的。复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像A. 环状双链环状双链DNA及及复制起始点复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori535533553复制子复制子(replicon)33 5 3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)随从链随从链(

4、lagging strand)3 5 3 5 半不连续性半不连续性 复制过程中，领头链连续复制复制过程中，领头链连续复制，而随从链不连续复制的现象，而随从链不连续复制的现象。 冈崎片段冈崎片段(okazaki fragment) 不连续复制的片段不连续复制的片段 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化The Enzymology and Topology of DNA Replication第二节第二节 参与参与DNA复制的物质复制的物质 模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链底物底物(substrate): dNTP DNA聚合酶聚合酶(poly

5、merase): 简写为简写为 DNA-polRNA引物引物(primer): 提供提供3 -OH使使dNTP聚合聚合其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子一、一、复制的化学反应复制的化学反应 目目 录录磷酸二酯键的生成磷酸二酯键的生成N1OH35+dN2TPN1N2-OH35+PPiDNA pol聚合聚合 DNA新链生成需引新链生成需引物和模板物和模板；活性：活性：1. 53 聚合活性聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性二、二、DNA聚合酶聚合酶DNA-pol 的的 5 3 聚合作用聚合作用35 5335DNA-pol15/625 3 OHP3 5 外切外切5 3 外切外切5 3

6、内切酶内切酶(Endonuclease)（限制性内切酶）（限制性内切酶）5 3 3 5 外切外切 5 3 外切外切(Exonuclease)外切酶与内切酶作用图解外切酶与内切酶作用图解16/621. 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶1. 53 的聚合活性的聚合活性 2.35 外切酶活性外切酶活性DNA-polDNA-pol DNA-pol 功能：功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）DNA-pol I 5 3 外切酶活性的功能外切酶活性的功能切除引物，切除突变片段切除引物，切

7、除突变片段5317/62DNA-pol I 3 5 外切酶活性的功能外切酶活性的功能校读校读（proofread）功能功能53AG17/62323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子生进行分子生物学研究中常用的工具酶物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依基因发生突变，细菌依

8、然能存活。然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复损伤的应急状态修复。 功能功能: : 是原核生物复制延长中真正起催化是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶作用的酶。 DNA-pol (250kD)段段2. 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用和填补缺口的作用。仅存在于线粒体仅存在于线粒体DNA复制中复制中。DNA-pol DNA-pol DNA-pol

9、DNA-pol 三、复制的保真性三、复制的保真性 (fidelity) 1. 遵守严格的碱基配对规律遵守严格的碱基配对规律 ATGC2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 DNA pol 靠其大分子结构协调非共价靠其大分子结构协调非共价( (氢键氢键) )与共价键与共价键( (磷酸二酯键磷酸二酯键) ) 的有序形成的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对时，嘌呤应处于反相应的嘧啶形成氢键配对时，嘌呤应处于反式构型式构型。 DNA pol III 在催化磷酸二酯键形成之前完在催化磷酸二酯键

10、形成之前完 成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和 力较顺式的大力较顺式的大。A：DNA-pol 的外切酶活性切除错配碱基；的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。不表现活性。解链酶类：解链酶类：解螺旋酶解螺旋酶拓扑异构酶拓扑异构酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白四、四、复制中的解链和复制中的解链和DNA分子拓扑学变化分子拓扑学变化 引物酶引物酶1. 解螺旋酶解螺旋酶 (helicase)作用作用：断裂互补碱基间的氢键，使：断裂互补碱基间的氢键，使D

11、NA成单链。成单链。DnaA、B (rep蛋白、蛋白、解螺旋酶解螺旋酶)、C等等解螺旋酶解螺旋酶ATP2. 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA-binding protein, SSB) 作用作用：防止单链：防止单链DNA重新形成双链，防止重新形成双链，防止 单链单链DNA被核酸酶水解被核酸酶水解。3. 引物酶引物酶 (primase) 5 5 催化催化RNA引物引物合成的酶叫合成的酶叫引物酶引物酶，它是一种特，它是一种特殊的殊的RNA聚合酶。聚合酶。DNA合成需在合成需在RNA引物引物的基础上进行。的基础上进行。RNA引物引物5 3 5 3 4. DNA拓

12、扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase, Topo) DNA正超螺旋与负超螺旋正超螺旋与负超螺旋负超螺旋负超螺旋正超螺旋正超螺旋DNA双螺旋双螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶1010 8 8 局部解链后局部解链后解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成 拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶 分分 类类切割切割DNA双链双链，此时，此时不需不需ATP；尔后；尔后由由ATP供能供能，使，使DNA分子成分子成负超螺旋负超螺旋再连接再连接切口切口

13、。不需不需ATP，切割双链，切割双链DNA中的中的一链一链，使使DNA松弛后松弛后, 连接切口。连接切口。Topo:Topo: 临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过鬼臼乙叉甙等）是通过抑制抑制Topo酶活性酶活性而杀而杀死肿瘤细胞的。死肿瘤细胞的。 作用机制作用机制 五、五、DNA连接酶连接酶 (DNA ligase) 作用方式作用方式 催化催化DNA双链的双链的3 羟基羟基和相邻的和相邻的5 磷磷酸基团酸基团形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键，从而把两段相，从而把两段相邻的邻的DNA链连成完整的链。链连成完整的链。DNA连接酶连接酶ATPAT

14、PPOO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPAMP+PPi5353目目 录录 在复制中起最后接合缺口的作用；在复制中起最后接合缺口的作用； 在在DNA修复、重组及剪接中起缝合修复、重组及剪接中起缝合缺口作用；缺口作用； 基因工程的重要工具酶之一。基因工程的重要工具酶之一。 功能功能 参与参与DNA复制的主要成员复制的主要成员主要成员主要成员主要作用主要作用DnaADnaB ( (解螺旋酶解螺旋酶) )SSBDnaG (引物酶引物酶)TOPODNA-pol DNA-polDNA连接酶连接酶DnaC 识别复制起始位点识别复制起始位点 解开解开DNA双链双链 运送和协同运送和协

15、同DnaB 合成合成RNA引物引物 维持已解开单链维持已解开单链DNA的稳定的稳定 使打结、缠绕、正超螺旋的使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰松驰 DNA复制复制 水解引物、填补空隙、修复作用水解引物、填补空隙、修复作用 催化双链催化双链DNA中单链缺口的连接中单链缺口的连接DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第三节第三节复制的起始复制的起始复制的延长复制的延长复制的终止复制的终止（一）（一）复制的起始复制的起始 (initiation )需要解决两个问题需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板解开成单链，提供模板。2. 合成引物

16、，提供合成引物，提供3 -OH末端末端。一、一、原核生物的原核生物的DNA生物合成生物合成 由特定蛋白质识别复制起始位点由特定蛋白质识别复制起始位点(ori)，在解螺旋酶、在解螺旋酶、TOPO酶及单链酶及单链DNA结合蛋结合蛋白的共同作用下，白的共同作用下，DNA解链，解旋，解链，解旋，形形成复制叉成复制叉。 倒倒Y1. DNA解链解链E.coli复制起始点复制起始点 oriC E.coli复制起始点复制起始点oriC跨度为跨度为245bp，有有3组串联重复序列和组串联重复序列和2对反向重复序列对反向重复序列。E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNT

17、TNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 Dna A Dna B、 Dna CSSB3 5 3 5 复制叉的形成复制叉的形成5 3 3 5 引物酶引物酶DnaC引发体引发体解螺旋酶解螺旋酶含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域

18、的复合结构称为引发体复制起始区域的复合结构称为引发体。 2. 引发体的生成引发体的生成3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶DNA拓扑异构酶拓扑异构酶3. RNA引物合成引物合成（二）（二）复制的延长复制的延长 (elongation)复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol 催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成键的不断生成。 3 AAGACCTATT5 5 TTCTGGATAA3 dATP

19、+DNA pol 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四1. 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的，双向复制的 汇合点就是复制的终止点。汇合点就是复制的终止点。oriter8232（三）（三）复制的终止复制的终止2. 领头链上的领头链上的RNA引物被引物被RNA酶水解后，酶水解后， 由由DNA pol I 催化，由新合成链提供催化，由新合成链提供 3 -OH补齐。补齐。5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP

20、5 5 PATP AMP+PPi5 5 DNA连接酶连接酶3. 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接（一）复制的起始（一）复制的起始二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA5 3 3 5 随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的复制中岡崎片段的连接，复制子之间的 连接。连接。 染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA 引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。（三）复制的终

21、止（三）复制的终止5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 5 反转录和其他的复制方式反转录和其他的复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四节第四节反反转录酶转录酶 (reverse transcriptase) 反反转录转录 (reverse transcription)现象现象 逆转录逆转录酶酶一、反转录病毒和反转录酶一、反转录病毒和反转录酶 反转录酶是反转录酶是多功能酶多功能酶，有三种酶活性：，有三种酶活性：1. 反转录活性：反转录活性：即以即以RNA为模板合成为模板合成DNA2. RNase

22、活性：活性：水解水解RNA:DNA中的中的RNA3. DNA pol活性：活性：以以DNA为模板合成为模板合成DNA反转录病毒细胞内的逆转录过程反转录病毒细胞内的逆转录过程RNA 模板模板反转录酶反转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA反转录酶反转录酶双链双链DNA反转录酶反转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应分子生物学研究可应用反转录酶，作为获取基用反转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方因工程目的基因的重要方法之一，此法称为法之一，此法称为cDNA法。法。 以以mRNA为

23、模板，经反为模板，经反转录合成的与转录合成的与mRNA碱基碱基序列互补的序列互补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 二、反转录研究的意义二、反转录研究的意义 反转录酶和反转录现象，是分子生物学研究中反转录酶和反转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 反转录现象说明：至少在某些生物，反转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对反转录病毒的研究，拓宽了对反转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 端粒端粒DNA端粒结合蛋白端

24、粒结合蛋白三、端粒酶三、端粒酶 端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构分子末端的结构功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性 结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含T、G 碱基的短序列。碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG 功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性 端粒酶端粒酶 (telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telom

25、erase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶反转录酶端粒酶反转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成: : 作用：作用：l 填补子链填补子链5 -末端末端引物水解后留下的空隙，防引物水解后留下的空隙，防 止止DNA缩短缩短。目目 录录端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂 抗抗衰衰老老 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation

26、) and Repair第五节第五节遗传物质的结构改变而引起的遗传遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为信息改变，均可称为突变突变 (mutation)。在复制过程中发生的在复制过程中发生的DNA突变称为突变称为DNA损伤损伤 (DNA damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分分子上碱基的改变。子上碱基的改变。 一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础二、引发

27、突变的因素二、引发突变的因素 物理因素物理因素: 紫外线紫外线 (ultra violet, UV)、各种辐射、各种辐射 UV化学因素化学因素常常见见的的化化学学诱诱变变剂剂化化合合物物类类别别作作用用点点分分子子改改变变碱碱基基类类似似物物如如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟羟胺胺类类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚亚硝硝酸酸盐盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷烷化化剂剂如如：氮氮芥芥类类，NitrominsG mGG mGDNA缺缺失失G三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型错配错配 (mismatch)缺失缺

28、失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) DNA分子上的碱基错配又称分子上的碱基错配又称点突变点突变 (point mutation)发生在同型碱基之间，即嘌呤代替发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。转转换换发生在异型碱基之间，即嘌呤变发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。嘧啶或嘧啶变嘌呤。颠颠换换（一）错配（一）错配镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移突变和框移突变缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DN