乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A

1、乙酰肝素的反义寡核甘酸对肺癌A549细胞侵袭力的抑制作用作者：陈志涛田辉1岳韦名1李林1亓磊1朱应超1作者单位：(山东大学附属济南市中心医院胸外科，山东济南250013)【摘要】目的探讨乙酰肝素酶(heparanaseHPSE)反义寡核甘酸(antisenseoligodeoxynucleotideASODN)对人肺癌A549细胞侵袭力的抑制作用。方法设计合成互补于HPSEmRNA起始密码区的HPSEASODN,以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人肺癌A549细胞进行培养，采用流式细胞分析技术和逆转聚聚合葩链反应(RTPCR)方法检测肺癌A549细胞HPSE蛋白及其mRNA表达的变化

2、；以Matrigel细胞侵袭试验对HPSEASODN对肺癌A549细胞侵袭的抑制进行检测。结果ASODN各组与正常对照组和脂质体组比较及ASODN各组间比较HPSEmRNA和蛋白的表达及细胞侵袭力均受到明显抑制(P<0.01);ASODN在终浓度为100、200、400nmol/L时对肺癌A549细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%和91.2%。结论HPSEASODN通过下调HPSEmRNA和蛋白的表达可显著抑制肺癌A549细胞的侵袭力，并呈剂量依赖性。【关键词】肺肿瘤;乙酰肝素酶；反义寡核甘酸Inhibitionofinvasivenessofhumanlungcancerc

3、elllinesbyheparanaseantisenseoligodeoxynucleotideCHENZhiTao,TIANHui,YUEWeiMing,etal.DepartmentofThoracicSurgeryJi'nanCentralHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Ji'nan250013,ShandongChinaAbstractObjectiveToevaluatetheinhibitoryeffectofHPSEantisenseoligodeoxynucleotide(ASODN)ontheinvasivene

4、ssofhumanlungcancerA549celllines.MethodsHPSEASODNwhichwascomplementarywithinitiationcodonregionofHPSEmRNAwasdesignedandsynthesized.AfterembeddedbycationlipofectinitwastransfectedintoA549cellsofhumanlungcancer.TheexpressionofHPSEproteinandHPSEmRNAinA549celllinesweredetectedbyflowcytometryandRTPCR.Mea

5、nwhileMatrigelinvasiveassaywasusedtomeasuretheinhibitoryeffectofHPSEASODNontheinvasivenessofhumanA549celllines.ResultsTheHPSEproteinandHPSEmRNAexpressionandinvasivenessofhumanA549cellstreatedwithASODNofdifferentconcentrationsweresignificantlydecreasedastheASODNconcentrationincreasing.Therewasasignif

6、icantdifferencebetweencontrolgroupandeachgroupofASODNrespectively(P<0.01),betweenlipofectingroupandeachgroupofASODNrespectively(P<0.01),andamongthegroupsofASODN(P<0.01).BesidesthedifferenceofinhibitoryeffectwassignificantamongthecellstreatedwithdifferentASODNconcentrations(P<0.01).Theinh

7、ibitionratesofA549cellinvasivenesswere55.6%82.3%and91.2%treatedbyASODNatfinalconcentrationof100200and400nmol/Lrespectively.ConclusionsBydownregulatingtheexpressionofHPSEmRNAandHPSEproteinHPSEASODNhassignificantinhibitoryeffectontheinvasivenessofhumanA549celllineinadosedependentmanner.【KeywordsLungne

8、oplasm;Heparanase;Antisenseoligodeoxynucleotide侵袭和转移是肺癌的重要特征，是导致肺癌病人死亡的主要因素。乙酰肝素酶(heparanaseHPSE)是迄今为止发现的唯一能够降解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素(heparansulfateHS)的酶，对于肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作用1。本研究采用反义寡核甘酸(ASODN)技术转染人肺癌A549细胞，用逆转录聚合酶傩反应(RTPCR邪流式细胞学方法检测A549细胞HPSEmRNA和蛋白表达，同时采用基质凝胶侵袭实验对转染细胞的侵袭力进行检测，以初步探讨HPSEASODN对A549细胞的影响。1材

9、料与方法1.1 细胞培养人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所，所有培养工作均在无菌环境下进行，培养于含有10%小牛血清的RPMI1640中，实验所用细胞均处于对数增长期。1.2 反义寡脱氧核甘酸的设计、合成根据HPSE基因序列(GenBankaccessionnumberAF155510)。设计互补于HPSEmRNA起始密码区(AUG及其下游17个核甘酸序列)ASODN序列：ASODN5!GGCTTCGAGCGCAGCAGCA13'，在GenBank中行Blastn证实ASODN仅与HPSE基因相应位点匹配。以上寡核甘酸序列由上海生工生物工程公司合成、纯化，并行硫代磷酸化修饰，同时

10、以荧光素FITC标记末端碱基。1.3 实验分组实验设正常对照组（转染时不加脂质体，不加寡核甘酸卜脂质体对照组（转染时仅加脂质体，不加核甘酸）、ASODN组（转染时加脂质体和100、200、400nmol/LASODN）。根据预试验结果，各实验组在以上3种终浓度时转染率较高且不同浓度间无显著差别，故选择此浓度梯度进行实验。1.4 寡核甘酸的转染采用阳离子脂质体Lipofectin（Invitrogen公司）转染。将细胞接种于6孔板，置于37C、5%CO2孵育箱培养至约70%覆盖率。去除培养基，以温热无血清RPMI1640漂洗细胞2次。将寡核甘酸分别溶于100Ml无血清RPMI1640,另取10M

11、lLipofectin溶于90Ml预暖的无血清RPMI1640,分置室温30min后将两者轻柔混合，室温孵育15min,以800Ml无血清RPMI1640稀释LipofectinODN复合体后轻铺于细胞上，不加抗生素，37C、5%CO2孵箱孵育6ho培养过程中设复孔常规以台盼蓝染色法检测细胞死亡率，各组细胞死亡率均5%。1.5 RTPCR测定HPSEmRNA的表达取转染后继续培养48h的肺癌A549细胞，以TRIzol试剂（Gibco公司）提取总RNA,以紫外分光光度计测定RNA纯度并定量，在1%甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。RTPCR采用一步法试剂盒（KaTaRa公司）按厂家推荐步骤进

12、行，扩增体系为50Ml。本实验以Bactin作为对照，对模板用量标准化。HPSE和Bactin分两管进行扩增。引物序列参照文献1设计，由上海生工生物工程公司合成。HPSE(585bp)h游5.1TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3'下游51GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC3'Bactin(250bp)上游5!CAGAGCAAGAGAGGCATCC13',下游5!GGATAGCACAGCCTGGATAG3',RTPCR条件：50c逆转录30min,95c预变性5min,94c变性1min,55c退火1min,72c延伸1min,30个循

13、环后，72c充分延伸10min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，PCR产物电泳结束后，紫外灯下观察照相并用Gel1D凝胶图像分析系统分析测定其光密度，各电泳条带净密度值按下列公式计算：净密度值二条带平均密度X面积(Pix),以HPSE条带净密度与Bactin条带净密度的比值表示HPSEmRNA相对表达量进行半定量比较。1.6 HPSE的流式细胞学检查取单细胞悬液1X106/ml,加入兔抗人HPSE单克隆抗体工作液100Ml(购自武汉博士德公司)，室温孵育30min,加入PBS10ml洗涤1次，弃上清，加入羊抗兔FITCIgG二抗工作液100Ml,避光室温孵育30min,加入PBS10ml离

14、心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS0.1ml经500目铜网过滤后上机检测。设HPSE一抗的本底对照和阴性对照。采用美国BeckmanCoulter公司生产的EpicsXLII型流式细胞仪，激发光源为15mW鼠离子激光器，激发波长为488nm,应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，用多循环AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前以flowcheckTMFluorpheres（10Mm）荧光微球（REF6605359.BeckmanCoulter;Inc.Fullerton,CA92835）作为标准样品调整仪器CV值在2%以内。以荧光指数表示HPSE蛋白的相对含量

15、。1.7 基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力采用BD公司24孔基质凝胶侵袭小室，上下室间滤膜孔径为8Mm,滤膜的上室面覆有细胞外基质凝胶，可模拟体内的细胞外基质和基底膜环境。取转染后继续培养24h的A549细胞，以无血清RPMI1640制成2X105个/ml单细胞悬液，取200Ml移入上室内，下室内加入500Ml含有10%小牛血清的RPMI1640,置于37C、5%CO2孵箱内孵育48h后取出，以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，侵袭到下室面的细胞以甲醛固定（HE染色），在X400光镜下随机取6个视野计数细胞数，以其均值表示侵袭细胞数。细胞侵袭力抑制率二（脂质体对照组每视野侵袭细胞数不同浓度ASODN

16、组每视野侵袭细胞数）/脂质体对照组每视野侵袭细胞数X100%。1.8 统计学处理数据以x土s表示，采用SPSS13.0软件包进行两样本间均数间独立样本的t检验及多个样本间的单因素方差分析。2结果2.1 HPSEASODN转染A549细胞情况HPSEASODN在终浓度为100、200、400nmol/L时平均转染效率分别为97%、98%、95%,三种终浓度的转染率比较无显著差别（P>0.05）。2.2 RTPCR检测ASODN对HPSEmRNA表达抑制作用半定量RTPCR扩增产物电泳结果（图1,表1）显示：正常对照组和脂质体对照组之间比较，HPSEmRNA表达量差异不显著（P>0.0

17、5）;随着ASODN浓度的增加，HPSEmRNA表达依次下降，ASODN的抑制作用具有明显的剂量依赖性。ASODN各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN各组间HPSEmRNA表达比较差异显著（P<0.01）。1:正常对照组；2:脂质体对照组；3:ASODN组（100nmol/L）;4:ASODN组（400nmol/L）图1RTPCR检测HPSEmRNA的表达2.3 流式细胞学检测ASODN对HPSE蛋白表达的抑制作用流式细胞学检测结果（表1）显示：正常对照组和脂质体对照组之间比较，HPSE蛋白表达的荧光指数（FI）差异不显著（P>0.05）;随着ASODN浓度的增加，H

18、PSE蛋白表达的FI依次减小且呈明显剂量依赖性;ASODN各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN各组间比较差异显著（P<0.01）。表1HPSEASODN对A549细胞HPSE蛋白及其侵袭力的影响与正常对照组和脂质体组比较：1）P<0.01与ASODN100nmol/L组比较：2）P<0.01;与ASODN100、200nmol/L组比较：3）P<0.012.4 ASODN对A549细胞侵袭力的抑制作用正常对照组和脂质体对照组之间比较，侵袭细胞数无明显变化（P>0.05）;随着ASODN浓度的增加，侵袭细胞数依次减少，ASODN各组分别与正常对照组和脂

19、质体对照组比较及ASODN各组间侵袭细胞数比较差异显著(P<0,01);ASODN对细胞侵袭力的抑制作用呈明显剂量依赖性(表1)。即ASODN在终浓度为100、200、400nmol/L时对A549细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%、91.2%(图2)。图2不同浓度HPSEASODN组A549细胞穿透基底膜的侵袭细胞数(HE,X400)3讨论早在1975年Hk等就发现一种降解HS侧链的内切糖甘酶，并首次对此酶的活性进行了描述。此后，Hulett2等克隆出了人类HPSE基因序列，使相关的研究进入了新的阶段。人类HPSE基因定位于染色体4q21.3位置，cDNA全长1758bp,

20、编码的活性蛋白质分子量为50kD1,2。HPSE在正常组织中的表达主要局限于胎盘和免疫器官，而在多种恶性肿瘤中有高水平表达37。研究发现HPSE的表达水平与肿瘤细胞的侵袭和转移潜能密切相关。肿瘤细胞的侵袭和转移，必须突破细胞外基质和基底膜屏障。细胞外基质是由多种大分子组成的复杂网络系统，主要成分为IV型胶原、层黏连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖由一个蛋白质核心和多条HS侧链构成。基底膜是一种特殊的细胞外基质，呈坚固的薄纸样结构。肿瘤细胞能够分泌多种降解酶，破坏细胞外基质和基底膜屏障，常见的有基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等蛋白酶家族成员。HPSE是一种糖昔内切酶，可在数个位点

21、上降解HS,从而破坏细胞外基质和基底膜的完整性，促进肿瘤细胞侵袭和转移。目前的研究发现，HPSE是唯一具有降解HS活性的酶1，这使HPSE成为研究抗肿瘤转移药物的新靶点。ASODN通过碱基互补原理，与目的mRNA特定序列特异性结合，形成DNARNA杂合双链，诱导内源性RNA降解酶H对mRNA链进行水解，并通过空间位阻效应阻断mRNA剪切加工、转运和蛋白质翻译合成，从而达到基因治疗的目的8。Uno等9曾将HPSE反义核酸通过腺病毒载体导入人食管癌细胞系，明显降低了其HPSE表达水平和体外侵袭能力。我们针对HPSEmRNA的起始密码区设计合成了ASODN,通过硫代磷酸化修饰增强其稳定性和抗酶解能力

22、。寡核甘酸可通过被动扩散和细胞膜受体介导的胞吞作用进入细胞。阳离子脂质体在一定比例内能够中和寡核甘酸所带的负电荷，使寡核甘酸易于通过细胞膜，提高转染率。本实验通过半定量RTPCR、流式细胞学检测和Matrigel细胞侵袭实验说明，HPSEASODN能够在不同水平下调HPSEmRNA及其蛋白的表达，从而显著降低肺癌A549细胞的侵袭力，此抑制作用表现出明显的剂量依赖性。这表明，HPSE参与肺癌细胞的侵袭和迁移，在肺癌细胞侵袭和转移中起重要作用，HPSE可能会成为预防和治疗肺癌侵袭和转移的新靶点通过HPSEASODN可能为肺癌的基因治疗提供一条新的途径，可望为肺癌的基因治疗提供有意义的理论依据。【

23、参考文献】1 VlodavskyI,FriedmannY,ElkinM,etal.Mammalianheparanasegenecloning,expressionandfunctionintumorprogressionandmetastasisJ.NatMed,1999;5(7):793802.2 HulettMD,FreemanC,HamdoriBJ,etal.CloningofmammalianheparanaseanimportantenzymeintumorinvasionandmetastasisJ.NatMed,1999;5(7):8039.3 ShafatI,PodeD,PeretzT,etal.ClinicalsignificanceofurineheparanaseinbladdercancerprogressiohJ.Neoplasia,2008;10(2)：12530.4 Nobuhisa