Bt伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用学习教案

1、会计学1Bt伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用伴胞晶体毒蛋白的结构功能和应用第一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第1页/共73页第二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 Bacillus thuringiensis (Bt)Sporulated cultureCrystal第2页/共73页第三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第3页/共73页第四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。苏云金芽胞杆菌能产生7种毒素蛋白-内毒素-外毒素-外毒素-外毒素不稳定外毒素水溶性毒素鼠因子外毒素CryCryCryCryCry-Cyt第4页/共73页第五页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第5页/共7

2、3页第六页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第6页/共73页第七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第7页/共73页第八页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。本实验室主要研究内容：第8页/共73页第九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。1.毒素蛋白的基本特征和分类毒素蛋白的基本特征第9页/共73页第十页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。米粒状晶体 YBT-1518毒素蛋白的基本特征球形晶体B.thuringiensis M15菱形晶体第10页/共73页第十一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。毒素蛋白的分类 第11页/共73页第十二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。毒素蛋白的分类

3、 第12页/共73页第十三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。毒素蛋白的分类 第13页/共73页第十四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。毒素蛋白在Bt中的分布 第14页/共73页第十五页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。2.毒素蛋白的结构和功能 第15页/共73页第十六页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。Cry5BaCry1Aa2.毒素蛋白的结构和功能 第16页/共73页第十七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 Swiss-PdbViewer显示Cry蛋白三维模型IIIIIIPymol显示Cry蛋白三维模型2.毒素蛋白的结构和功能 第17页/共73页第十八页，编辑于星期五：二十一

4、点 三十九分。Pymol预测蛋白质表面相对静电荷2.毒素蛋白的结构和功能 第18页/共73页第十九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。Molsoft预测cry蛋白活性位点2.毒素蛋白的结构和功能 第19页/共73页第二十页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。2.毒素蛋白的结构和功能 2.1 结构域：第20页/共73页第二十一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。2.1.1“铅笔刀”模型： 第21页/共73页第二十二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。伞状模型2.1.2 “伞状模型” ： 第22页/共73页第二十三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。2.1.3 “5螺旋六聚体”模型： 第2

5、3页/共73页第二十四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 2.2 结构域： 第24页/共73页第二十五页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。2.3 结构域： 第25页/共73页第二十六页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。2.4 三个结构域之间的相互作用 第26页/共73页第二十七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第27页/共73页第二十八页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.毒素蛋白与昆虫的作用机理 毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 第28页/共73页第二十九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 第29页/共73页第三十页，编辑于星期五：二十

6、一点 三十九分。毒素蛋白与昆虫受体的相互作用模式： 第30页/共73页第三十一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。第31页/共73页第三十二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.2 毒素蛋白受体： 第32页/共73页第三十三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.2.1 APN(aminopeptidase N) 第33页/共73页第三十四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.2.1.1 APN受体结合的毒素种类 第34页/共73页第三十五页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.2.1.2 APN受体对毒素插入质膜的介导 第35页/共73页第三十六页，编辑于星期五：二十一点 三十

7、九分。昆虫中肠 APN受体与 Bt 杀虫毒力 第36页/共73页第三十七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.2.2 类钙粘蛋白(Cadherin-like) 第37页/共73页第三十八页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。棉铃虫中肠类钙粘蛋白结构模型 3.2.2 类钙粘蛋白(Cadherin-like) 第38页/共73页第三十九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase ，ALP ） 第39页/共73页第四十页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。3.2.4 其他的毒素受体 Glyco-conujgate receptor第40页/共73页

8、第四十一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。毒素蛋白的应用 4.1 Bt在农业生产中的应用 第41页/共73页第四十二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 Bt的主要产品剂型 蔬菜蔬菜-水剂，撒粉剂水剂，撒粉剂水稻水稻-油剂，粉剂油剂，粉剂林木林木-油剂，粉剂油剂，粉剂卫生卫生-漂浮粒剂漂浮粒剂4.1 Bt在农业生产中的应用 第42页/共73页第四十三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。Bt 的主要市场4.1 Bt在农业生产中的应用 第43页/共73页第四十四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 主要防治对象小菜蛾小菜蛾菜青虫菜青虫棉铃虫棉铃虫玉米螟玉米螟稻稻 螟螟松毛虫松毛虫蚊子幼虫

9、蚊子幼虫 4.1 Bt在农业生产中的应用 第44页/共73页第四十五页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.1 Bt在农业生产中的应用 第45页/共73页第四十六页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.2 Bt毒素在抗病方面的应用 第46页/共73页第四十七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。白血病T细胞正常T细胞肝癌正常肝细胞4.2 Bt毒素在抗病方面的应用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL C

10、ell survival %Cell survival %第47页/共73页第四十八页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。白血病T细胞宫颈癌细胞4.2 Bt毒素在抗病方面的应用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL 第48页/共73页第四十九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.3 利用分子生物学技术定向进化毒素蛋白基因 第49页/共73页第五十页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.3.1 新的毒素基因的鉴定与克隆 4.3.1.1 Bt140菌株中cry2Ac6新基因的克隆： 第5

11、0页/共73页第五十一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 中其他功能基因的扩增 第51页/共73页第五十二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.3.2. 利用生化和分子生物学技术定向改造毒蛋白 4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第52页/共73页第五十三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第53页/共73页第五十四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。Cry蛋白中18- 19loop的结构与序列比对4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第54页/共73页第五十五页，编辑于星期五：二十

12、一点 三十九分。Cry1Aa蛋白结构，18- 19loop及与其相邻的残基4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第55页/共73页第五十六页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.3.2.1 利用基因定点突变技术，提高毒蛋白杀虫毒力 第56页/共73页第五十七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。Bt4基因组易错PCRCry1AcPCR回收TA克隆筛选PCR回收pET28aBL21表达毒素基因cry1Ac核心区改组文库通过易错PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第57页/共73页第五十八页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。突变子的表达1、对照Cry

13、-B(1Ac）2、突变子T524N 3、Cry-B阴性对照 M、Maeker通过易错PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第58页/共73页第五十九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。通过易错PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第59页/共73页第六十页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。16小时32小时对照vip3基因在Bt无晶体突变株XBU001中的表达4.3.3 工程菌构建 4.3.3.1 中vip基因的克隆表达及重组杀虫工程菌构建 第60页/共73页第六十一页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。4.3.3.2 携带异源毒素基因的Bt工程菌

14、的构建 pH5AXI（ hwtx-XI ）在菌株中的表达 1,Bt4.0718; 2-4, Bt4.0718(pH5AXI). 第61页/共73页第六十二页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。采用EGFP抗体(A)和-ACTX 抗体(B)对Cry1Ac-ACTX-Hv1a-egfp融合蛋白的Western-blot检测 工程菌伴胞晶体的原子力显微镜检测A、Cry1-B(1Ac-ACTX-EGFP) B、Cry1-B(1Ac）4.3.3.2 携带异源毒素基因的Bt工程菌的构建 第62页/共73页第六十三页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。5.苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究 5.1 Bt杀虫晶体蛋

15、白质组研究 第63页/共73页第六十四页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。 A B C D（A）、Bt武汉亚种（B）、和以色列亚种H14(C)、伴胞晶体杀虫晶体蛋白的双向电泳及其与HD-1杀虫晶体蛋白的gel spot的匹配图谱(D)5.2 不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究 第64页/共73页第六十五页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。菌株Bt4.0718菌株、Bt库斯塔克亚种HD-1Bt以色列亚种H14武汉亚种140斑点数1229126 1129025220105.2 不同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究 第65页/共73页第六十六页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。5.2 不

16、同亚种杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究 第66页/共73页第六十七页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。5.3 Bt工程菌株杀虫晶体的蛋白质组学研究 A B Bt4（Phah43）（A）、XBU001(pHTAcS60)（B）晶体蛋白的双向电泳图第67页/共73页第六十八页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。NoImage 对部分特征蛋白质点进行原位酶解、肽质量指纹图分析，鉴定到Bt菌株和转Bt菌株含有Cry1Aa，Cry1Ac等蛋白，还发现第四期芽胞蛋白A，翻译延伸因子-Tu，丙氨酸脱氢酶，丙酮酸脱氢酶E1复合物，亚单位，伴侣蛋白DnaK，ATP合成酶链，丙酮酸脱氢酶E3复合物等部分伴侣蛋白。如下表所示：5.3 Bt工程菌株杀虫晶体的蛋白质组学研究 第68页/共73页第六十九页，编辑于星期五：二十一点 三十九分。5.4 Bt菌株的全蛋白质