waters_e2695_training

1、-中心实验室 唐翠娥Waters High Performance Liquid Chromatography（HPLC） Training52341目目 录录HPLC 基础知识简介基础知识简介 HPLC 系统组成部件系统组成部件 软件操作软件操作 Waters e2695实验操作实验操作常见色仪器和色谱图故障常见色仪器和色谱图故障正相色谱法反相色谱法固定相极性高低中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出适用范围溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物较广，非极性至中等极性的组分表表1.1.正相色谱法与反相色谱法比较表 HPLC 基础知识简介基础知识简介3HPLC 基础知识

2、简介基础知识简介Chromatogram3HPLC 基础知识简介基础知识简介PeakPeak BasePeak HeightPeak WidthPeak Width at Half HeightPeak AreaTailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰假峰BaselineBaseline Drift:Baseline Noise:Band Broadening:组分在色谱柱组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象内移动过程中谱带宽度增加的现象。色谱图名词术

3、语色谱图名词术语3HPLC 基础知识简介基础知识简介3HPLC 基础知识简介基础知识简介理论塔板数(N): 分离效率的量度, 3HPLC 基础知识简介基础知识简介3 容量因子容量因子k3分离因子分离因子 3HPLC 基础知识简介基础知识简介理论塔板数(N): 分离效率的量度, 填料颗粒度越小填料颗粒度越小,N 越大；流动相流速越大；流动相流速V 越高越高,N 越大。柱长越厂，越大。柱长越厂，N越大。越大。3k， 和和N N，如何控制？，如何控制？ HPLC 系统系统组成部件组成部件 Waters HPLC 系统系统组成组成 硬件系统：泵(515,1515,1525,600,616,626)进样

4、器(7725i,717Plus)色谱柱(Symmetry C18, NovaPakC18,)检测器(2698/2996, 2487,2475,EMD)2695/2795分离单元(溶剂管理与样品管理集成为一体)软件系统：软件系统：积分仪(746)、工作站(PC800）数据管理系统Breeze、Millennium32、EmpowerMasslynx4.0软件平台(LC-MS)Waters HPLC 系统系统1525-717-2487-Breeze系统1525-717-2998-Empower系统Waters 1525泵系统泵系统Waters 717自动进样器自动进样器48 or 96位样品样品盘

5、位样品样品盘可单独操作也可外部控制可单独操作也可外部控制(IEEE)Waters 2998 PDA检测器检测器PDA检测器的三维检测器的三维(3D)图图Waters HPLC 系统系统Alliance 系统:-2690/5分离单元-2998检测器-Empower2 控制软件Waters的的HPLC系统系统Waters e2695系统系统-1.梯度比例阀(GPV);2.进口阀;3.主柱塞（传送溶液）;4.主压力传感器;5.蓄积柱塞（向系统输送液体）;6.系统压力传感器;7.独立的线性柱塞驱动马达（与传统一个马达驱动串联或并联泵相比，无压力波动，没有出口阀，减少故障率）流速精度达到0.075%Wa

6、ters e2695 进样系统系统进样系统系统五个独立的24位样品盘Waters 2998 PDA检测器检测器PDA检测器的三维检测器的三维(3D)图图Waters液相操作液相操作1、溶剂准备、溶剂准备：色谱纯级别色谱纯级别a): 过滤过滤0.45m滤膜（滤膜（纤维素膜水溶液，纤维素膜水溶液， 尼龙、尼龙、PTFE通用型通用型）b):脱气脱气超声超声3-5min，排除，排除O2，N2等。等。保证流量准确，提高色谱图重现保证流量准确，提高色谱图重现性，增加信噪比（低紫外去氧气吸收），保护色谱柱（填料氧化）。性，增加信噪比（低紫外去氧气吸收），保护色谱柱（填料氧化）。c):溶剂截止波长溶剂截止波长

7、：最好避免，如乙腈和水：最好避免，如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇甲醇和乙醇210nm,等。等。d):缓冲盐流动相缓冲盐流动相：需现配现用，低温密封保存最多：需现配现用，低温密封保存最多3天；天； 有机溶剂和缓冲盐（水）混配流动相，需低温保存。有机溶剂和缓冲盐（水）混配流动相，需低温保存。e):溶剂混溶性溶剂混溶性：建议用色谱纯：建议用色谱纯10%异丙醇异丙醇or水作为过渡溶剂。水作为过渡溶剂。Waters液相操作液相操作1、溶剂准备、溶剂准备： 1525系统系统：A,B两通道流动相，针头清洗液（绿色）。两通道流动相，针头清洗液（绿色）。 e2695系统系统： 流动相流动相-最多可以做最多可

8、以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脱四通道梯度混合洗脱。灌注柱塞密封清洗液（灌注柱塞密封清洗液（seal wash）-一般建议使用一般建议使用10%20%甲醇甲醇水溶液。水溶液。针头清洗液（绿色）针头清洗液（绿色）- 一般选择样品最后几分钟洗脱相似的溶剂一般选择样品最后几分钟洗脱相似的溶剂作为洗脱溶剂。作为洗脱溶剂。 Waters液相操作液相操作2、开机一般流程：、开机一般流程：开启开启HPLC系统各个设备的电源。系统各个设备的电源。 1525系统系统：开泵、柱温箱、自动进样器开泵、柱温箱、自动进样器:待设备通过自检后，打开计待设备通过自检后，打开计算机。算机。打开检测器电源打开检测器电源:检

9、测器通过自检后（检测器通过自检后（3-5min）,才能被软才能被软件控制件控制, 建议有流动相流经检测器后再开启电源建议有流动相流经检测器后再开启电源。启动色谱管理软件启动色谱管理软件,1525系统没有控制版面，所有操作都系统没有控制版面，所有操作都需在软件上执行。需在软件上执行。 Waters液相操作液相操作 e2695系统系统：1）打开电源开关）打开电源开关，仪器启动诊断程序会开，仪器启动诊断程序会开始始屏幕上会显示Main界面，继续进行针头、注射器和阀门，样品转盘托架和溶剂管理系统这些机械部件进行诊断测试，测试成功后，系统进入“Idle”状态。常见问题：“plunger homing o

10、ver pressure ”，初始化中断。解决办法：打开排液阀，重新初始化。Waters液相操作液相操作 2）打开在线脱气机）打开在线脱气机：在面板中直接操作或者软件中打开。 Waters液相操作液相操作3）色谱泵排气：）色谱泵排气：3.1）dry prime: 干抽，仪器停放很长干抽，仪器停放很长时间后管路空了，无法时间后管路空了，无法wet prime时，时，用于快速排空气泡。用于快速排空气泡。Waters液相操作液相操作3.2） Wet prime: 湿抽湿抽， 快速替换管路中溶剂用的。注意：快速替换管路中溶剂用的。注意：溶剂的互溶性，溶剂的互溶性，如：如：在由缓冲溶剂改为高有机物含量的

11、溶剂在由缓冲溶剂改为高有机物含量的溶剂时，为避免时，为避免“分离单元分离单元”内出现盐沉淀，请使用中间溶剂内出现盐沉淀，请使用中间溶剂（如水）。（如水）。在在 Main （主）屏幕中，按（主）屏幕中，按 Menu/Status 显示显示 Status （状态）屏幕。按（状态）屏幕。按 Direct Functions 菜单。菜单。排气后系统输液温度，压力波动小排气后系统输液温度，压力波动小,一般在几十一般在几十Psi以内以内),否则否则,需重做排气操作需重做排气操作Waters液相操作液相操作4）清洗进样器系统：清洗进样器系统：当更换流动相或者发现注射器内有气泡当更换流动相或者发现注射器内有气

12、泡时（时（纯甲醇清洗纯甲醇清洗），需要对进样系统进），需要对进样系统进行清洗，主要包括对定量环和注射器的行清洗，主要包括对定量环和注射器的清洗清洗 。Waters液相操作液相操作2、系统平衡：跑基线系统平衡：跑基线 正确安装色谱柱后，用准备好的流动相平衡系统，大约正确安装色谱柱后，用准备好的流动相平衡系统，大约0.51h.3、样品准备样品准备：过滤，样品瓶中应有超过过滤，样品瓶中应有超过1/3高度高度 的样品量。的样品量。4、编制仪器方法，开始试验，编制仪器方法，开始试验，软件操作。软件操作。5、清洗清洗：实验结束后，应对液相系统（进样器、泵、检测器等）、实验结束后，应对液相系统（进样器、泵、

13、检测器等）、色谱柱进行清洗色谱柱进行清洗。建议批量进样后，最后进一针建议批量进样后，最后进一针50ul流动相，如果流动流动相，如果流动相中有盐，则用纯水代替缓冲盐那部分比例相中有盐，则用纯水代替缓冲盐那部分比例。清洗后色谱柱和系统中需。清洗后色谱柱和系统中需填充需要的溶剂。填充需要的溶剂。6、关机关机：退出：退出Empower控制软件，依次关闭泵，检测器，电脑等电控制软件，依次关闭泵，检测器，电脑等电源。源。Waters软件操作软件操作1、登入登入2、项目建立项目建立 3、方法编辑、方法编辑。Empower中所有功能都需要相应的中所有功能都需要相应的“方法方法”去实去实现。现。 仪器方法仪器方

14、法：设置仪器参数采集样品：设置仪器参数采集样品 处理方法处理方法：对色谱数据进行处理计算：对色谱数据进行处理计算 报告方法报告方法：对色谱结果打印报告：对色谱结果打印报告 输出方法输出方法：输出色谱数据。：输出色谱数据。 方法组方法组：将上述方法组合，从而可以进行数据的批处理。：将上述方法组合，从而可以进行数据的批处理。4、单次进样和样品组进样5、3D数据处理6、打印报告Waters软件操作软件操作常见仪器故障常见仪器故障-Troubleshooting1、流动相及溶剂瓶流动相及溶剂瓶 流动相脱气不充分易引起噪声大，出现毛刺峰。溶剂过滤器流动相脱气不充分易引起噪声大，出现毛刺峰。溶剂过滤器堵塞

15、会引起流动相供给不畅，压力不稳。流动相被污染了会引堵塞会引起流动相供给不畅，压力不稳。流动相被污染了会引起基线上升，梯度洗脱出现鬼峰。起基线上升，梯度洗脱出现鬼峰。2、初始化错误初始化错误：Plunger homing over pressure-在线过在线过滤器堵塞。滤器堵塞。3、泵常见故障、泵常见故障：Lost Prime-单向阀堵死。单向阀堵死。4、进样器故障进样器故障：需使用匹配的进样瓶，易出现进样针堵塞，：需使用匹配的进样瓶，易出现进样针堵塞，空白溶剂出现色谱峰时，需加倍清洗或者调整样品浓度顺序空白溶剂出现色谱峰时，需加倍清洗或者调整样品浓度顺序（L-H）。）。 常见仪器故障常见仪器

16、故障-Troubleshooting5、色谱柱故障：、色谱柱故障：6、检测器故障、检测器故障：灯故障易引起噪声大，灵敏度下降。灯故障易引起噪声大，灵敏度下降。流动相和样品脏易引起流通池污染和堵塞故障流动相和样品脏易引起流通池污染和堵塞故障。常见仪器故障常见仪器故障-Troubleshooting7、堵堵-压力高压力高柱压升高，升高的依据应该跟之前相同条件下所得的柱压进行柱压升高，升高的依据应该跟之前相同条件下所得的柱压进行对比。对比。堵应该先排除是系统堵还是柱子堵，首先断开色谱柱，连接两堵应该先排除是系统堵还是柱子堵，首先断开色谱柱，连接两通，如果压力超过通，如果压力超过1500psi，那么系

17、统肯定是堵了，滞后逐一，那么系统肯定是堵了，滞后逐一排查，清洗或者更换被堵部件。排查，清洗或者更换被堵部件。Notes:溶剂吸滤头溶剂吸滤头,进出口阀及管路进出口阀及管路(包括进样器和检测池包括进样器和检测池)若被污染若被污染,应作清应作清洗和钝化处理。一般采用洗和钝化处理。一般采用30磷酸水溶液作为清洗剂，用磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化化剂，先清洗再钝化。清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢。钝。清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢。钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜。化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜。（清洗钝

18、化步骤：设（清洗钝化步骤：设ABCD25% 1ml/min 水水-30%磷酸磷酸or6M硝酸硝酸 45min-水至中性水至中性-甲醇）甲醇）常见仪器故障常见仪器故障-Troubleshooting 色谱柱堵塞引起压力高色谱柱堵塞引起压力高，可能由于填料表面物质吸附，可能由于填料表面物质吸附或沉淀引起，则需对色谱柱进行清洗，建议方法低流速或沉淀引起，则需对色谱柱进行清洗，建议方法低流速清洗。清洗。反相色谱柱：水，甲醇，四氢呋喃，二氯甲烷反相色谱柱：水，甲醇，四氢呋喃，二氯甲烷, 甲醇甲醇 和水和水正相色谱柱：二氯甲烷，四氢呋喃正相色谱柱：二氯甲烷，四氢呋喃THF, 水水,甲醇，甲醇， 二氯甲烷。二氯甲烷。如果还是不行，则可考虑反冲或者购买新柱如果还是不行，则可考虑反冲或者购买新柱。常见色谱图故障常见色谱图故障-Troubleshooting1、色谱图保留时间变化问题、色谱图保留时间变化问题A）前后两针进