PRDX5基因启动子的荧光素酶报告质粒的构建-最新资料

1、PRDX盅因启动子的荧光素幅报告质粒的构建ConstructionofLuciferaseReporterPlasmidPRDXSGenePromoterHULe-lin(SchoolofMedicine,TheAnhuiUniversityofScienceandTechnology,Huainan232001,Anhui,China):ObjectiveToconstructapGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidandtovertifyingitsluciferaseactivity.Methods®searchthenucleicacidsequence

2、ofthepromoterPRDX5bybioinformaticsanalysis.MethodsofPCRwasperformedtoamplifythepromoterPRDX5.thepromoterPRDX5wasinsertedintopGL3-BasiccloningvectortoconstructluciferasereporterplasmidwiththepromoterPRDX5DpGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidwasverifiedbydouble-enzymecleavageandsequencingmethod.ResultspGL3-

3、PRDX5-promoter-Lucplasmidwasidentifiedtobecorrectbydouble-enzymecleavageandsequencingmethod.ConclusionApGL3-PRDX5-promoter-Lucplasmidwassuccessfullyconstructed.PRDX毙Peroxiredoxins(PRDXs过氧化物酶家族蛋白的一种，研究显示在它广泛表达于哺乳动物的各种细胞，定位于细胞质、过氧化物酶体和线粒体中，但在许多细胞中PRDX庭要定位于线粒体，它与组织过氧化物、过氧化亚硝基阴离子有高的亲和力1。Masakishiota2等人发

4、现在外源过氧化氢处理或组织缺氧情况下人类前列腺癌PC3细胞PRDX费达增高。研究还显示人类定位于线粒体的PRDX5保护线粒体DN隐受过氧化氢的损伤。并且PRDX3够抑制p53诱导的活性氧簇的产生和细胞凋亡3。1材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌种、质粒和细胞系大肠杆菌tans-5a购自Trans-Gene（全式金）公司；载体质粒pGL3-Basic,由本室保存。1.1.2 DNA重组所用工具酶及试剂BglII、MluI等限制性内切酶，TaqDNAPolymerase,T4DNALigase购自NewEnglandLab和Promega公司。大提质粒试剂盒购自威格拉斯仪器XX公司。其它常规

5、试剂均为进口分装或国产分析纯。1.2 方法1.2.1 用PCRF口酶切的方法得到目的片段利用DNAI取试剂盒在U2OSM胞中提取全基因组细胞作为模板，根据已知PRDX5cDNA列，由生物信息学方法自UCS喷据库分析其可能的转录起始位点，选择TSS上游约1200bp下游约200bp范围作为其可能的启动子序列进行引物设计。预计扩增片段长度为1400bp。我们使用软件DNAMA附析其上可能存在的限制性内切酶位点，结合载体质粒pGL3-Basic上的限制性内切酶位点，选择分别在上、下游引物末端，添加Bglll、MluI限制性内切酶位点序列。见表1。1.2.2 目的片段与相应载体的连接将扩增好的目的片段

6、和PGL3-basic-Luc进行同样的双酶切鉴定，回收酶切产物，并进行质粒连接反应。在10"的反应体系中加入载体、插入片段、T4DNAligase、T4DNAligasebuffer。载体与插入片段的摩尔数之比控制在1:3,且二者的总量控制在300ng500ng之间，置于4c冰箱连接16h。目的片段和PGL3-basic-Luc通过BglII、MluI酶切位点连接重组质粒PGL3-PRDX5-promoter-Luc。1.2.3 筛选阳性质粒并测序将连接产物转化E.coliDH5?感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，酶切正确的质粒送至公司测序确定。2结果2.1 生物信息学方法预测PRDX

7、砧动子序列根据已知的PRDX5cDNAf歹U,在UCSCGenomeBioinformatics(/)数据库中，预测其可能的转录起始位点。根据预测的转录起始位点，将其上游约1200bp下游约200bp范围作为可能的启动子序列。2.2 PCR方法扩增预测序列根据预测启动子的序列设计引物，利用DNAfg取试剂盒在U2OSM胞中提取全基因组细胞作为模板，用PCR式剂盒扩增出约1.4kb的目的条带。见图1。图1PCRT增PRDX5promoter结果2.3 构建pGL3-PRDX5-promoter-Luc荧光素酶报告基因质粒将扩增好的目的片段和PGL3-basic-Lu

8、c进行同样的双酶切鉴定，回收酶切产物，并进行质粒连接反应。再将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，接种在带氨芾西林的LB固体培养基中，37C孵育过夜后。挑出阳性克隆，提取质粒并进行酶切鉴定。图2为0.8%的琼脂糖凝胶结果，可看出在相应的大小条带上出现阳性结果。图2PRDX痘动子片段连接入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic酶切鉴定。挑选的克隆扩增后所提质粒进行KpnI、NheI限制性内切酶双酶切。2.4 筛选阳性质粒并测序将连接产物转化E.coliDH5?感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，酶切正确的质粒送至公司测序确定。3讨论PRDX毙Peroxiredoxins过氧化物酶家族蛋白的一种，但在许多细胞中PRDX驻要定位于线粒体。在氧化应激情况下PRDX球族蛋白能将H2O2转化为水，清除ROS抵抗ROS寸细胞的损害4。YuanZhou等在哺乳动物细胞中首次证实PRDX5发挥抗氧化剂功能，抑制p53诱导产生的细胞内ROSPRDX5勺晶体结构研究显示，与PRDX琮族的其它成员相比，PRDX瞑