荧光光谱教学文案

1、l荧光是怎么产生的？有什么用途？荧光是怎么产生的？有什么用途？l常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？l荧光强度和物质浓度是什么样的关系荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪还有哪些因素会影响到荧光强度？些因素会影响到荧光强度？l荧光光谱的有哪些光谱参数荧光光谱的有哪些光谱参数(cnsh)？l有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么用途？用途？第一页，共37页。1）荧光）荧光(ynggung)产生及其物理机制产生及其物理机制第二页，共37页。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越(

2、kuyu)(kuyu)内转换内转换振动振动(zhndng)(zhndng)弛豫弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换(zhunhun)(zhunhun)l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫第三页，共37页。第四页，共37页。第五页，共37页。1 1）荧光）荧光(ynggung)(ynggung)的激发光谱，发射谱的激发光谱，发射谱 激发谱：固定测量波长激发谱：固定测量波长( (选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发化合物发射的荧光射的荧光(ynggung)(ynggung)强度与激发光波长的关系曲线强度与激发光波长的关系曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的

3、分子(fnz)最多，荧光强度最大；荧光光谱有荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。两类。通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。长的关系。第六页，共37页。第七页，共37页。 a.Stokes a.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波

4、长无关(wgun)(wgun) 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量( (如如能级图能级图 2 , 2 , 1) 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光的荧光( (如如 2 ) 2 )。 c. c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。形状一样）成镜像对称关系。 第八页，共37页。 基态上的各振动能级分布与第一(dy)

5、激发态上的各振动能级分布类似（振动波函数一样）； 基态上的零振动(zhndng)能级与第一激发态 的 二 振 动(zhndng)能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 第九页，共37页。光源光源(gungyun) 激发(jf)单色器样品池样品池检测器检测器发射单色器发射单色器检测器检测器荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背景荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背景是没有入射光，是是没有入射光，是“暗背景暗背景”，因此灵敏度更高。，因此灵敏度更高。1）荧光光谱仪）荧光光谱仪第十页，共37页。I0dFdxkceIeeIdIkcxdxxkckcx0)(01 00kclkcxeAkIdx

6、kceAIdIAFkclkclkclkclekcl1! 3)(! 2)(132第十一页，共37页。cIKF0 第十二页，共37页。3）.荧光光谱荧光光谱(gungp)的环境效应的环境效应第十三页，共37页。1）荧光光谱）荧光光谱(gungp)参数：参数： /t0eFF公式中的公式中的即为荧光寿命即为荧光寿命第十四页，共37页。荧光荧光(ynggung)寿命和量子产率示意图寿命和量子产率示意图Q为量子产率，为量子产率，为荧光为荧光(ynggung)发射速发射速率，率，knr为非辐射转移速率为非辐射转移速率,n为荧光为荧光(ynggung)自然寿命自然寿命.通常量子效率和波长通常量子效率和波长相关

7、，但生化的荧光相关，但生化的荧光(ynggung)通常和波长通常和波长无关。无关。 /1k1kQnnrnr第十五页，共37页。XYZFFaeIp和和同时描述荧光同时描述荧光(ynggung)偏振。偏振。从对称性考虑，从对称性考虑，Fx=Fy, 通常用通常用描述荧光描述荧光(ynggung)偏振偏振p3p2rr22r3p 第十六页，共37页。第十七页，共37页。 荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。 狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。分子

8、的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起荧原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起荧光效率降低或激发态寿命缩短光效率降低或激发态寿命缩短(sudun)(sudun)，导致强度降低。，导致强度降低。 卤素离子、重金属离子、氧分子都是猝灭剂。卤素离子、重金属离子、氧分子都是猝灭剂。研究主要集中在可测量的研究主要集中在可测量的“狭义荧光猝灭狭义荧光猝灭”。生化方面主要应用猝灭现象指示分子之间的相互作用。生化方面主要应用猝灭现象指示分子之间的相互作用。揭示发色团和猝灭剂的接近程度，反映发色团在蛋白和膜揭示发色团和猝灭剂的接近程度，反映发色团在蛋白和

9、膜上的局域位置，质子的通透性和膜的通透性上的局域位置，质子的通透性和膜的通透性 。碰撞猝灭可以用来确定猝灭及的扩散系数。碰撞猝灭可以用来确定猝灭及的扩散系数。采用采用Stern-VolmerStern-Volmer方程来解释方程来解释第十八页，共37页。第十九页，共37页。1000QKFFQFFFKFQFFQFFQKsss（2)静态静态(jngti)猝灭猝灭第二十页，共37页。第二十一页，共37页。XYZFF设发射振子和设发射振子和Z轴夹角为轴夹角为Y为荧光检测为荧光检测(jin c)方向方向（2）.荧光偏振的定量荧光偏振的定量(dngling)描述描述2/ )1cos3(3/231p12/

10、)cos1(2/ )1cos3(p21ddcoscossincoscossincoscosp22222222222 第二十二页，共37页。（1 1）能量转移：）能量转移：Fluorescent resonance energy transferFluorescent resonance energy transfer（FRET)FRET)术语术语(shy)(shy)：Frster resonance energy transferFrster resonance energy transfer纪念德国科学家纪念德国科学家 Theodor Frster Theodor Frster Theodo

11、r Frster Theodor Frster 简介简介 19101910生于德国法兰克福，生于德国法兰克福，19331933获获Ph.DPh.D。19421942年前，年前，一直在研究一直在研究(ynji)(ynji)有机复合物的光吸收。有机复合物的光吸收。 二次大战二次大战后，于后，于19451945年加入马克思普朗克研究年加入马克思普朗克研究(ynji)(ynji)所。所。19461946年发表第一篇能量转移的文章。年发表第一篇能量转移的文章。能量转移与供体的发射谱和受体的吸收谱的重叠、量子产能量转移与供体的发射谱和受体的吸收谱的重叠、量子产率、距离、相对取向相关。率、距离、相对取向相关

12、。第二十三页，共37页。激发态的供体能量被受体吸收，荧光强度下降。激发态的供体能量被受体吸收，荧光强度下降。 能量转移可能以两种方式：辐射和非辐射。共振能量转移可能以两种方式：辐射和非辐射。共振转移的机制：转移的机制：偶极子相互作用通过非辐射进行能量转移（偶极子相互作用通过非辐射进行能量转移（10nm)10nm)。荧光能量转移的先决条件：荧光能量转移的先决条件：1)1)供体和受体有一定谱重叠供体和受体有一定谱重叠(chngdi)(chngdi)（共振能量转（共振能量转移）。移）。2)2)供体和受体距离比较近（正比于供体和受体距离比较近（正比于R6)R6)。3 3）供体和受体跃迁偶极距的方向不能

13、垂直）供体和受体跃迁偶极距的方向不能垂直（2）.能量转移的物理能量转移的物理(wl)机制机制第二十四页，共37页。Lakowicz，JR. Principles of Fluorescent Spectroscopy, 2nd Ed, Chapt.13 ，p369.能量转移经常用于测定能量转移经常用于测定(cdng)供体和受体的距离，称为供体和受体的距离，称为“光光谱尺谱尺”（ spectroscopic ruler），有时也会受到供体和受体的），有时也会受到供体和受体的扩散影响。扩散影响。第二十五页，共37页。第二十六页，共37页。第二十七页，共37页。一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相

14、关时间。一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相关时间。如果是球形的样品，将会有单一衰减指数如果是球形的样品，将会有单一衰减指数(zhsh)； 大多数情况将会有多个衰减指数大多数情况将会有多个衰减指数(zhsh)。 原因主要是样品为非球形蛋白质或样品中有不同运动状原因主要是样品为非球形蛋白质或样品中有不同运动状况的荧光发色团。衰减时间与沿各分子轴的旋转相关。况的荧光发色团。衰减时间与沿各分子轴的旋转相关。 如果样品内部某些片断是柔性的，衰减时间也会改变。如果样品内部某些片断是柔性的，衰减时间也会改变。因此荧光各向异性可用于研究蛋白的内部动力学。因此荧光各向异性可用于研究蛋白的内部动力学。 能量转

15、移也会影响各向异性衰减。能量转移也会影响各向异性衰减。 在膜蛋白的研究中，通过各向异性衰减也有很多信息。在膜蛋白的研究中，通过各向异性衰减也有很多信息。第二十八页，共37页。所得到的是平均结果。一般来讲，样品不会是完全均匀分所得到的是平均结果。一般来讲，样品不会是完全均匀分布也不是高度有序。布也不是高度有序。利用瞬态测量寿命时，式中的时间寿命是基于只有一个衰利用瞬态测量寿命时，式中的时间寿命是基于只有一个衰减时间的假设。但如果有多组分，则需要取平均寿命。减时间的假设。但如果有多组分，则需要取平均寿命。另外采用有供体和受体时的荧光强度，用的是积分强度。另外采用有供体和受体时的荧光强度，用的是积分

16、强度。在固体样品中，可以在固体样品中，可以(ky)(ky)克服样品在溶剂中旋转扩散的克服样品在溶剂中旋转扩散的影响。影响。荧光猝灭，荧光能量共振转移都可以荧光猝灭，荧光能量共振转移都可以(ky)(ky)影响荧光的寿影响荧光的寿命，因此用时间分辨谱进行研究。命，因此用时间分辨谱进行研究。（2）时间分辨）时间分辨(fnbin)寿命寿命第二十九页，共37页。有些物质不发荧光，而且生化分子中如氨基酸中只有少数残基发荧光，有些物质不发荧光，而且生化分子中如氨基酸中只有少数残基发荧光，成为内源荧光。成为内源荧光。如染料与与研究对象结合，作为探针应用荧光方法与蛋白质结合后吸附如染料与与研究对象结合，作为探针

17、应用荧光方法与蛋白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分子间距离等。加入染料不应影响大分子的结构加入染料不应影响大分子的结构加入染料不应影响大分子的功能加入染料不应影响大分子的功能标在不同位置标在不同位置(wi zhi)，效果不同。，效果不同。标记方法：标记方法：1）有转基因标记：）有转基因标记：单点转基因标记单点转基因标记: 把某个氨基酸改变成把某个氨基酸改变成Trp,或者转变成或者转变成Cys再与荧光探针再与荧光探针结合。结合。荧光蛋白：在蛋白中插入含发色团的荧光蛋白，荧光蛋白：在蛋白中插入含发色团的荧光蛋白

18、，GFP, YFP, 1）绿色荧光）绿色荧光蛋白（蛋白（GFP,green fluorescent protein）BFP第三十页，共37页。第三十一页，共37页。第三十二页，共37页。2）量子）量子(lingz)点荧光标记点荧光标记量子量子(lingz)点：点：Quantum Dot量子量子(lingz)点又可称为半导体纳米微晶体。目前研究较多的点又可称为半导体纳米微晶体。目前研究较多的主要是硫化镉、硒化镉和碲化镉（主要是硫化镉、硒化镉和碲化镉（CdS、CdSe 和和CdTe） 。量子量子(lingz)点由于粒径很小点由于粒径很小(约约1100 nm)，因此光学行为与，因此光学行为与一些大分

19、子相似一些大分子相似, 可以发射荧光。可以发射荧光。量子量子(lingz)点的体积大小严格控制着它的光吸收和发射特征。点的体积大小严格控制着它的光吸收和发射特征。晶体颗粒越小晶体颗粒越小, 比表面积越大比表面积越大, 分布于表面的原子就越多分布于表面的原子就越多,量子量子(lingz)尺寸效应越强尺寸效应越强 , 从而使其光吸收带蓝移从而使其光吸收带蓝移, 荧光发射峰位荧光发射峰位也相应蓝移。也相应蓝移。第三十三页，共37页。单独的量子点颗粒容易受多种因素影响单独的量子点颗粒容易受多种因素影响, 荧光量荧光量子产率很低。但是当以其为核心子产率很低。但是当以其为核心, 用另一种半导体用另一种半导

20、体材料包覆材料包覆, 形成核形成核-壳结构后壳结构后, 就可将量子产率提高就可将量子产率提高到约到约50% , 甚至甚至(shnzh)更高更高, 因而有很强的荧光因而有很强的荧光发射。目前已合成了多种核发射。目前已合成了多种核-壳结构的纳米颗粒壳结构的纳米颗粒, 如如CdS/ Ag2S、CdS/ Cd (OH)2、CdS/ ZnS、ZnS/ CdSe、ZnSe/ CdSe、CdS/ HgS、CdS/ PbS 等，等，以及多层结构的以及多层结构的CdS/ HgS/ CdS第三十四页，共37页。1.激发量子点的激发光波长范围很宽激发量子点的激发光波长范围很宽,因此不同大小的因此不同大小的(CdSe

21、) ZnS 量子点可以由同一波长的光激发。量子点可以由同一波长的光激发。2. 量子点具有较大的半径位移和狭窄对称的荧光谱峰量子点具有较大的半径位移和狭窄对称的荧光谱峰, 这样就允许同时使用不同光谱特征这样就允许同时使用不同光谱特征(tzhng)的量子点的量子点, 而发射光谱不出现交叠而发射光谱不出现交叠, 或只有很少交叠或只有很少交叠, 使标记生物使标记生物分子荧光谱的区分、识别变得很容易。分子荧光谱的区分、识别变得很容易。3.量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成材料来量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成材料来“调谐调谐”, 因而可获得多种可分辨的颜色。因而可获得多种可分辨的颜色。4. 量子点比有机荧光分子要稳定量子点比有机荧光分子要稳定, 它可以经受反复多次它可以