病原生物学实验一

1、病原生物学教研室病原生物学教研室郝振华郝振华病原生物学实验一病原生物学实验一主要内容主要内容生物安全生物安全培养基的制备培养基的制备消毒灭菌消毒灭菌生物安全生物安全操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的操作在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物微生物操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害下对人、动物或者环境不构成严重危害操作能够引起人类或者动物严重疾病，比操作能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物动物与动物间传播的微

2、生物操作能够引起人类或者动物非常严重疾操作能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，尚无有效预防或治疗方法病的微生物，尚无有效预防或治疗方法P4P4实验室实验室P2P2实验室实验室P1P1实验室实验室P3实验室实验室病原生物学实验室规则病原生物学实验室规则 学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒。要经常清洗消毒。 进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内。的储物柜内。 严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。

3、手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。 实验过程中避免一切不良的个人习惯；实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要操作中产生的废料要扔在指定容器内扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。实验室意外紧急处理办法实验室意外紧急处理办法 1 1 皮肤破损皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后：去除异物，生理盐

4、水或蒸馏水洗净后2%2%碘酊或碘酊或2%2%红红汞涂抹。汞涂抹。 2 2 烧伤：局部涂凡士林，烧伤：局部涂凡士林，2%2%鞣酸或鞣酸或2%2%苦味酸。苦味酸。 3 3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%2%硼酸洗涤中硼酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1 12 2滴滴眼）。滴滴眼）。 4 4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，菌液入口：立即吐入消毒容器内，1 1：10001000高锰酸

5、钾或高锰酸钾或3%3%双氧水双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。漱口，根据菌种服用抗菌药物。 5 5 菌液污染台面菌液污染台面：2%3% %来苏尔或来苏尔或0.1%0.1%新洁尔灭覆盖新洁尔灭覆盖3030分钟后抹分钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3 3分后肥皂和清水洗净。分后肥皂和清水洗净。 6 6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。常用培养基的制备常用培养基的制备 掌握制备常用的培养基的制备方

6、法熟悉培养基制备的基本程序 实验目的实验目的实验原理实验原理v培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。代谢产物的营养基质。v人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。良好的营养条件。培养基配制要素v营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无机盐；机盐；v适宜的酸碱度适宜的酸碱度(pH(pH值值) )和一定缓冲能力；和一定缓冲能力；v一定的氧化还原电位；一定的氧化还原电位；v合适的渗透压。合适的渗透压。 根据微生物的种类和实验目的的不

7、同，培养根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基分类可以按以下方式：基分类可以按以下方式：1.按按成分成分的不同分的不同分2.按培养基的按培养基的物理状态物理状态分分3.按培养基的按培养基的用途用途分分培养基的分类培养基的分类按照培养基的成分来分：按照培养基的成分来分：v天然培养基天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质主要成分是复杂的天然有机物质v合成培养基合成培养基:用化学成分完全了解的纯化合物药用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基品配制而成的培养基v半合成培养基半合成培养基:以天然有机物作为微生物营养来以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品源的同

8、时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基所配制的培养基按照培养基的物理状态：v固体培养基固体培养基：加入凝固剂，如：加入凝固剂，如1.5% 2.0%琼脂琼脂v半固体培养基半固体培养基：加入少量凝固剂，如：加入少量凝固剂，如 0.2% 0.7%琼脂琼脂v液体培养基液体培养基：不含任何凝固剂：不含任何凝固剂按照培养基的用途：按照培养基的用途：v 基础培养基基础培养基v 营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）v 鉴别培养基：鉴别培养基：含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的培养基上培养后，它所产

9、生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。v 选择培养基：选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的生物的目的。 高压蒸气灭菌器、电热干燥箱、电炉、高压蒸气灭菌器、电

10、热干燥箱、电炉、天平、量筒、漏斗、试管、培养皿、烧杯、天平、量筒、漏斗、试管、培养皿、烧杯、三角烧瓶、三角烧瓶、 营养琼脂培养基、营养琼脂培养基、SSSS琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、琼脂等肉汤培养基、琼脂等仪器材料方法步骤方法步骤（一）营养琼脂培养基（二）SS琼脂培养基（三）液体培养基（四）半固体培养基（一）营养琼脂培养基（一）营养琼脂培养基 计算称量溶化倒平板或倒试管灭菌无菌检验备用 1计算：计算： 根据营养琼脂培养基的说明书了解营养琼脂粉与水的比例，一般是1000 ml蒸馏水中应加营养琼脂粉32g，再根据培养基的需要量确定营养琼脂粉的用量。 营养琼脂粉的量=31.315n/

11、1000 （g） 其中： 15代表一个平板需要营养琼脂约15 ml； n代表要做的培养基平板的数量 2称量：称量： 用普通天平准确称量出营养琼脂粉的量，用量筒量出相应的 蒸馏水的量，要尽量准确。 3溶化： 将营养琼脂粉和蒸馏水倒入搪瓷缸中，于电炉上加热溶化，边加热边搅拌，沸腾时立即从电炉上拿下，等泡沫消失后再放在电炉上加热，注意不能让琼脂溢出，煮沸23次。 4试管分装：试管分装：若做斜面培养基应倒入试管若做斜面培养基应倒入试管中，量为试管的中，量为试管的1/31/3。分装过程中，注意不要使培分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免养基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。污染棉塞而引

12、起污染。5灭菌：用高压灭菌器灭菌灭菌：用高压灭菌器灭菌 将三角瓶、试管口盖上将三角瓶、试管口盖上棉塞或橡胶塞，用纸包扎好，棉塞或橡胶塞，用纸包扎好，直 立 放 入 内 筒 中 ， 在直 立 放 入 内 筒 中 ， 在121.3121.3灭菌灭菌20-3020-30minmin。 灭菌完毕后，将三角瓶灭菌完毕后，将三角瓶中的培养基无菌倒入平皿内中的培养基无菌倒入平皿内制成平板，凝固前勿动；将制成平板，凝固前勿动；将试管培养基摆成斜面，凝固试管培养基摆成斜面，凝固前勿动。前勿动。 倒倒平平板板操操作作示示意意图图12346无菌检验：无菌检验： 随机抽取几个平板或试管培养基于温箱中培养24小时，若无

13、菌 生长则为合格。7备用：备用： 将合格的平板培养基和试管培养基放入冰箱，在0-4中保存备用。（二）（二）SS琼脂培养基琼脂培养基 按比例称取SS琼脂粉，溶解后灭菌，无菌倾注平皿制成平板。 常用于沙门氏及志贺氏菌的分离。 （三）肉汤培养基（三）肉汤培养基1成分 牛肉膏35g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。2制法 将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠加蒸馏水后，加热溶解。矫正pH至7.47.6，过滤分装。置高压蒸气灭菌器内，121.3灭菌20min即成。3用途 可供一般细菌生长，同时也是制作一般培养基的基础原料。供营养要求较高的细菌分离培养，亦可供溶血性的观察和保存菌种。（四）半固体培养基（

14、四）半固体培养基 肉汤培养基中加入0.3%0.5%琼脂粉制成，用于菌种的保存或观察细菌的运动性。 实验操作内容实验操作内容 营养琼脂培养基营养琼脂培养基 600ml（营养琼脂（营养琼脂19.2g），分装），分装2个三角个三角 瓶每瓶瓶每瓶300ml，其中其中1瓶加热融化后分装瓶加热融化后分装 10支斜面支斜面，每管，每管6ml 。 半固体培养基半固体培养基 100ml（肉汤粉（肉汤粉3g+琼脂粉琼脂粉0.5g），）， 加热融化后加热融化后分装至分装至10支试管，每管支试管，每管6ml 。 液体培养基液体培养基 100ml（肉汤粉（肉汤粉3g），）， 混匀后直接混匀后直接分装至分装至10支试管，

15、每管支试管，每管6ml。 SS培养基培养基 200ml（SS琼脂琼脂12.4g） 混匀后直接灭菌。混匀后直接灭菌。消毒与灭菌消毒与灭菌v 消毒消毒是一般指采用物理、化学和生物的方法消除物体的是一般指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体的过程。表面病原菌和有害微生物营养体的过程。v 灭菌灭菌则是指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生则是指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程物的营养体、芽孢和孢子的过程。v 在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所

16、都要进行严格染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。的消毒和灭菌。消毒与灭菌方法消毒与灭菌方法v加热灭菌加热灭菌干热灭菌干热灭菌湿热灭菌湿热灭菌v过滤除菌过滤除菌v辐射灭菌辐射灭菌放射线辐照灭菌放射线辐照灭菌紫外线灭菌紫外线灭菌v化学消毒剂化学消毒剂干热灭菌干热灭菌v 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。性而达到灭菌的目的。v 干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。v 细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体受热细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体

17、受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之凝固缓慢。快，反之凝固缓慢。v 因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160160170170），时间要长（），时间要长（1 12h2h），但干热灭菌温），但干热灭菌温度不能超过度不能超过180180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。甚至引起燃烧。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法压力：压力：1.05kg/cm2 或或103.425KPa温度温度: : 121.3时间：时间：15-20min完全杀灭细菌的

18、繁殖体和芽孢完全杀灭细菌的繁殖体和芽孢注意事项注意事项 锅内物品不宜过紧。锅内物品不宜过紧。 注意排出冷气，否则气压表虽已达注意排出冷气，否则气压表虽已达1515磅，温度磅，温度 达不到达不到121.3121.3，不能保证灭菌效果。，不能保证灭菌效果。 灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或 引起破裂。引起破裂。 不耐高热高压之物品，不能用此法。不耐高热高压之物品，不能用此法。过滤除菌过滤除菌过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于的化学成分，但由于滤量有限，所以