如何选题与课题设计

1、科研基本训练专题讲座科研基本训练专题讲座如何选题和设计课题如何选题和设计课题高成江高成江, , 教授教授, , 泰山学者泰山学者山东大学医学院免疫学研究所山东大学医学院免疫学研究所 88382292 (office), 88382113 (lab) Office: building 6, Rm 438 Email: 1.1.尽快完成观念的转变尽快完成观念的转变: : 从从“学生学生”转变为转变为“科研工作者科研工作者” 从从“学习学习”转变为转变为“研究研究”“”“探索探索”克服现在学生的一些弱点：克服现在学生的一些弱点：应试教育和就业问题，缺乏对科学研究的激情。应试教育和就业问题，缺乏对科学

2、研究的激情。众多众多“杂事杂事”，众多的，众多的“节假日节假日”。社会的浮躁与急功近利，潜不下心搞学问。社会的浮躁与急功近利，潜不下心搞学问。一、充分发挥自己的学习主动性一、充分发挥自己的学习主动性2.2.明确科学研究的目的明确科学研究的目的: :科学研究目的科学研究目的: :探索人类认识的未知领域探索人类认识的未知领域, ,探索真理探索真理.发现新事物，新现象；揭示新规律发现新事物，新现象；揭示新规律（阐明规律）（阐明规律） ；提供新认识提供新认识(新解释新解释) )。科研工作者的科研工作者的工作目的工作目的. .科研的动力：科研的动力：（1 1）追求）追求真理（好奇心，认死理）真理（好奇心

3、，认死理） ( (自然科学有自然科学有无穷魅力无穷魅力) )； （2）社会需求（指挥棒）；（）社会需求（指挥棒）；（3）功）功利驱使。利驱使。 事业心事业心, ,上进心上进心, ,虚荣心虚荣心1 1、定研究、定研究 “ “方向方向”和和“领域领域” 所在所在Lab（导师）固定的研究方向（导师）固定的研究方向1)熟悉实验室熟悉实验室PI的工作（查文献并浏览导师的工作（查文献并浏览导师发表的文章）发表的文章）2)参加参加 Lab meeting, Journal club 3)熟悉实验室工作环境与实验操作熟悉实验室工作环境与实验操作 (要泡实验要泡实验室；参与师兄姐实验室；参与师兄姐实验,第一学期

4、年第一学期年)，重点是熟，重点是熟悉实验仪器悉实验仪器二、如何选题，要做什么二、如何选题，要做什么2、复习文献，写出综述、复习文献，写出综述大量查阅并整理大量查阅并整理“课题课题”有关文献，撰写综述（是否发表？）有关文献，撰写综述（是否发表？） (第一学年第一学年/学期）学期）1） 掌握学科水准掌握学科水准; 当前重大进展与趋势当前重大进展与趋势2）了解焦点与热点）了解焦点与热点;已已/正正/将进行的研究课题将进行的研究课题3）(全面全面) 历史、现状、展望历史、现状、展望; 主要研究方法手段，实验技术主要研究方法手段，实验技术4）从文献中找蛛丝马迹（依据），按自己的学识创新思维，）从文献中找

5、蛛丝马迹（依据），按自己的学识创新思维，大胆假设。大胆假设。5）打消阴性（否定）结果的顾虑，阴性实验也具有科学价值）打消阴性（否定）结果的顾虑，阴性实验也具有科学价值(指路标与警示牌指路标与警示牌)免疫学领域研究热点免疫学领域研究热点 肿瘤免疫的研究进展肿瘤免疫的研究进展 固有免疫的研究进展固有免疫的研究进展 T细胞分群、分化、发育的研究进展细胞分群、分化、发育的研究进展 NK细胞的研究进展细胞的研究进展 microRNA与免疫调节与免疫调节 自身免疫病的病因及治疗自身免疫病的病因及治疗Key questions: how the innate immune response is regul

6、ated?MRegulatory proteins: TRIM38, TRIP, hnRNP UmicroRNA: 210, 147nTRAF-interacting Protein (TRIP): A Novel Component of the Tumor Necrosis Factor Receptor (TNFR)- and CD30-TRAF Signaling Complexes That Inhibits TRAF2-mediated NFkB Activation. J. Exp. Med. 1997nThe Tumor Suppressor CYLD Interacts wi

7、th TRIP and Regulates Negatively Nuclear Factor B Activation by Tumor Necrosis Factor. J. Exp. Med. 2003查文献，提假设成功的例子查文献，提假设成功的例子nEarly embryonic lethality caused by targeted disruption of the TRAF-interacting protein (TRIP) gene. BBRC. 2007nTRAF-interacting protein (TRIP) is a RING-dependent ubiquit

8、in ligase. BBRC. 2007nThe protein-tyrosine kinase SYK interacts with TRAF-interacting protein TRIP in breast epithelial cells .Oncogene. 2009 3、定、定“课题课题”： 凝练科学问题，提出明确的idea 1）导师研究生共同讨论制定，课题不要远离“方向”和“领域”。2）既考虑工作需要，也要尊重研究生的兴趣 3）注重工作的连续性与新领域的开拓 4）课题难易程度要考虑研究生能力5）利用临床资源的研究(注意伦理原则）6）现有的研究基础与工作条件，课题的前期研究工作

9、Novelty（新颖性）（新颖性）是否要有重要临床或学术价值？是否要有重要临床或学术价值？是否具有原创性？是否具有原创性？是否具有应用价值？是否具有应用价值？不是简单重复别人的实验（换材料），不是跟踪不是简单重复别人的实验（换材料），不是跟踪 。研究别人没有研究过的东西，难，但创新性强研究别人没有研究过的东西，难，但创新性强别人已研究过的东西，但可以研究它的新功能，别人已研究过的东西，但可以研究它的新功能，容易。容易。1 1、明确课题的研究目的和研究内容。、明确课题的研究目的和研究内容。 研究内容适当（做什么，编研究内容适当（做什么，编“故事故事”） 小心求证小心求证 小题大做深做小题大做深做

10、 不要大题小做浅做不要大题小做浅做；“深入深入”与与“全面全面”矛盾矛盾 针对研究目的（假说）决定研究内容针对研究目的（假说）决定研究内容 避免研究内容不足以得到预定目的（小于，少于）避免研究内容不足以得到预定目的（小于，少于） 避免研究内容超越预定目的（大于，多于）避免研究内容超越预定目的（大于，多于）三、设计课题，如何做三、设计课题，如何做 例例 背景：巨噬细胞活化可诱导新基因背景：巨噬细胞活化可诱导新基因A A的表达。的表达。假设：假设：A A基因可调控巨噬细胞的活化。基因可调控巨噬细胞的活化。课题：研究课题：研究A A基因对巨噬细胞活化的作用和机制。基因对巨噬细胞活化的作用和机制。研究

11、内容研究内容1. A1. A基因是否对巨噬细胞活化有作用？基因是否对巨噬细胞活化有作用？研究内容研究内容2 2：A A基因调控巨噬细胞活化的机制？基因调控巨噬细胞活化的机制？结论：结论：A A基因是巨噬细胞的活化调控因子。基因是巨噬细胞的活化调控因子。2、实验设计要严谨全面，特别是对照实验（包、实验设计要严谨全面，特别是对照实验（包括阴性和阳性对照）括阴性和阳性对照），病例数，严格质控，病例数，严格质控（repeat, duplicate)repeat, duplicate)对照试验检测你的实验体系；对照试验检测你的实验体系；一个试验至少要重复三次或更多次；一个试验至少要重复三次或更多次；测量

12、的数据要重复三次至六次；测量的数据要重复三次至六次；临床病例材料要几百例；临床病例材料要几百例；3、技术路线要合理、技术路线要合理4、实验方法要可靠并公认；动物模型要成熟公、实验方法要可靠并公认；动物模型要成熟公认。认。 方法选择：方法选择： 目的决定方法选择；目的决定方法选择；PCRPCR， WBWB 实验条件选方法；实验条件选方法；MSMS 工作者熟练程度选方法工作者熟练程度选方法 模型：经典与新建（是否需与人一致或接近）模型：经典与新建（是否需与人一致或接近）1）新基因的生物信息学分析: 编码产物预测分析 序列同源性分析 蛋白质功能域分析2）新基因的体内表达规律分析 mRNA水平的表达谱

13、分析 蛋白质水平的表达分析基因功能研究策略基因功能研究策略4）功能获得策略 基因转染技术 转基因技术5）功能失活策略 基于siRNA的基因沉默技术 基因敲除 检测的指标：炎性细胞因子的分泌6）基因编码产物相互作用蛋白的研究免疫共沉淀技术（co-IP)酵母双杂交系统FRED和FRET主要分子生物学技术 Western blotting-蛋白印迹 Confocal microscopy-激光共聚焦 Chromatin immunoprecipitation-染色质免疫沉淀 Real-time PCR-实时定量PCR 流式细胞术microRNA-210 negatively regulates LP

14、S-induced macrophage activation by targeting NF-B1BackgroundInnate immunityuThe bodys first line to defense against microbial infection.uMacrophages PRRRLRNLRTLRBackgroundBackgroundNF-BRHDNCNLSClass Ip50/p105(NF-B1)p52/p100(NF-B2)RHDTDNCNLSClass IIp65(RelA/ NF-B3)RelBRel(cRel)microRNAs Backgrounduhi

15、ghly conversed, small non-coding RNA molecules , 21-25ntuMature miRNA interacts with a specific mRNA through pairing of nucleotide bases between the miRNA sequence and the 3 untranslated region (3UTR) of specific mRNA, and leads to translational repression or target mRNA degradation uIn human，700 mi

16、RNAsthe expression of 20-30% genesBackgroundTaganov et al. NF-B-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. PNAS. 2006; 103(33): 1248112486. Liu et al. MiR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regula

17、tes murine macrophage inflammatory responses. PNAS. 2009; 106(37): 1581915824. Taganov et al. MicroRNAs and immunity: tiny players in a big field. Immunity. 2007; 26(2): 133137.Xiao et al. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 2009; 136(1): 2636. OConnell et al. MicroRNA-155

18、 is induced during the macrophage inflammatory response. PNAS. 2007; 104, 16041609. OConnell et al. Inositol phosphatase SHIP1 is a primary target of miR-155. PNAS.2009; 106(17): 71137118.Cardoso et al. miR-155 modulates microglia-mediated immune response by down-regulating SOCS-1 and promoting cyto

19、kine and nitric oxide production. Immunology. 2012;135(1):73-88. microRNAs play an important role not only in the differentiation and development of immune cells, but also in the regulation of immune response.BackgroundObjective100 ng/ml LPS, 24hMurine primary macrophagesExpression level of iNOS,TNF

20、- and IL-12p40 mRNAMicroarray analysis of miRNA expressionmiRNA expression with quantitative real-time PCRTechnical route 1 To identify microRNAs induced by LPS in murine macrophagesResults 1LPS-induced expression of miR-210 in murine macrophages.Fasanaro et al. MicroRNA-210 modulates endothelial ce

21、ll response to hypoxia and inhibits the receptor tyrosine kinase ligand Ephrin-A3. J Biol Chem. 2008; 283(23): 1587815883.Chan et al. MicroRNA-210 controls mitochondrial metabolism during hypoxia byrepressing the iron-sulfur cluster assembly proteins ISCU1/2. Cell Metab. 2009; 10(4):273284.Biswas et

22、 al. Hypoxia inducible microRNA-210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. PNAS. 2010; 107(15): 69766981.Chan et al. MicroRNA-210: a unique and pleiotropic hypoxamir. Cell Cycle. 2010; 9(6): 10721083. Tsuchiya et al. MicroRNA-210 regulates can

23、cer cell proliferation through targeting fibroblast growth factor receptor-like 1 (FGFRL1). J Biol Chem. 2011; 286(1): 420428.microRNA-210HIF-1 siRNAControl siRNAExpression ofHIF-1Peritoneal macrophagesExpression of miR-210To investigate whether HIF1- was involved in LPS-induced miR-210 expressionTe

24、chnical route 2Results 2 HIF1- increases miR-210 expression.miRNA-210 inhibitormiRNA-210 mimicsmiR-210 expressionPeritoneal macrophagesExpression and secretion of IL-6 and TNF-aTo investigate the possible role of miR-210 in LPS/TLR4 signaling for macrophageTechnical route 3Results 3-1miR-210 mimics

25、inhibits TLR4-induced proinflammatory cytokines expression.Results 3-2miR-210 inhibitor increases TLR4-induced proinflammatory cytokines expression.Technical route 4miRNA-210 mimic or control mimicMyD88, TRAF6, TAK1 plus TAB1, or IKK-, along with NF-B reporter plasmidHEK293To determine the function and molecular order of miR-210 in the LPS-induced NF-B activationResults 4miR-210 targets molecules downstream of IKK