第十一章荧光分析法

1、2022-5-8日立日立日立日立日立日立F-4500F-4500F-4500荧光光谱仪荧光光谱仪荧光光谱仪荧光光谱仪荧光光谱仪荧光光谱仪2022-5-8荧光分析法：是基于被测物质的荧光谱线位置及其强度进行荧光分析法：是基于被测物质的荧光谱线位置及其强度进行的分析方法（属于发射光谱法）。的分析方法（属于发射光谱法）。应用对象：应用对象：一般是能产生强荧光的分子或某些特定离子一般是能产生强荧光的分子或某些特定离子本章重点：本章重点：（1）分子荧光产生的过程（）分子荧光产生的过程（2）荧光与分子结构关系）荧光与分子结构关系（3）分子荧光定量方法）分子荧光定量方法 2022-5-8一、分子荧光与磷光的

2、产生过程一、分子荧光与磷光的产生过程一、分子荧光与磷光的产生过程一、分子荧光与磷光的产生过程一、分子荧光与磷光的产生过程一、分子荧光与磷光的产生过程1. 1. 分子电子能级与激发过程分子电子能级与激发过程分子能级比原子能级复杂；在每个分子的电子能级上，都存分子能级比原子能级复杂；在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级。多数在振动、转动能级。多数分子常温时处在基态最低振分子常温时处在基态最低振动能级，当吸收能量便可发动能级，当吸收能量便可发生能级间跃迁。生能级间跃迁。为便于说明电子跃迁过程，为便于说明电子跃迁过程，必须确定电子能级的多重性必须确定电子能级的多重性用符号用符号M M表示。表示

3、。 M=2S+1M=2S+1，S S轨道总自旋量子数轨道总自旋量子数 2022-5-8S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和( (要么为要么为0 0要么为要么为1)1)；S=0S=0时时M=1M=1，此时电子所处的能态为单重态用符号，此时电子所处的能态为单重态用符号S S表示。表示。S=1S=1时时M=3M=3，此时电子所处的能态为三重态用符号此时电子所处的能态为三重态用符号T表示。表示。平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态能级比相应单，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态用重态能级低；大多数有机分子的基态处于

4、单重态用S S0 0表示；表示； 2022-5-8电子吸收一定能量由基态电子吸收一定能量由基态(S0)向激发态发生跃迁向激发态发生跃迁若电子方向不改变若电子方向不改变产生激发单重态产生激发单重态(用用S1、S2表示表示) )若电子方向改变若电子方向改变产生激发三重态产生激发三重态(用用T1、T2表示表示)激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能级图见能级图) )；速度最快、激；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；发态寿命最短的途径占优势；2022-5-82.2.2.2.2.2.激发态激发态激发态激发态激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态

5、的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量和无辐射跃迁等方式失去能量传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换外转移外转移振动驰预振动驰预系间跨越系间跨越无辐射跃迁无辐射跃迁激发态停留时间越短、返回速度越快的途径，发生几率最大激发态停留时间越短、返回速度越快的途径，发生几率最大，发光强度相对也越最大；发光强度相对也越最大；荧光：荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光

6、：磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级；第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；2022-5-8S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫2022-5-8（1 1）振动弛豫）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VRVibrational Relaxation, VR）在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子通过与溶在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量以热的形式传递给周围的溶剂分子，

7、剂分子碰撞而将部分能量以热的形式传递给周围的溶剂分子，电子则从高振动能层返回到低的振动能级的过程，称为振动电子则从高振动能层返回到低的振动能级的过程，称为振动弛豫。该过程在同一电子能级内进行。弛豫。该过程在同一电子能级内进行。（2 2）内转换）内转换（Internal ConversionInternal Conversion，ICIC）对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁的过程，如能层之间

8、通过振动耦合产生无辐射跃迁的过程，如S S2 2-S-S1 1；T T2 2-T-T1 1。该过程在同一类电子能级相邻的激发态间进行。该过程在同一类电子能级相邻的激发态间进行。2022-5-8（3）外转换（）外转换（External Conversion，EC）受激分子与溶剂分子或其它分子相互碰撞而失去能量，从而受激分子与溶剂分子或其它分子相互碰撞而失去能量，从而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。该过程发生在。该过程发生在S1S0，T1S0（4）系间跨跃（）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC

9、）系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。发生在不同多重态之间过程称为系间跨跃。发生在不同多重态之间2022-5-8（5 5）荧光发射）荧光发射电子从第一激发单重态最低振动能级（时间电子从第一激发单重态最

10、低振动能级（时间1010-9-9-10-10-7-7s s）以）以辐射形式跃迁到基态各振动能级所产生的光子辐射称为荧辐射形式跃迁到基态各振动能级所产生的光子辐射称为荧光或荧光发射。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能光或荧光发射。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发光能量低，即荧光波长总是大于激发波长。通常要比激发光能量低，即荧光波长总是大于激发波长。（6 6）磷光发射）磷光发射电子从第一激发三重态的最低振动能级以辐射形式跃迁到电子从第一激发三重态的最低振动能级以辐射形式跃迁到基态的各个振动能级所产生的光子辐射称为磷光或磷光发基态的各个振动能级所产生的光子辐射称为磷光或磷光发射。由

11、于三重态振动能级比单重态的低，即磷光波长总是射。由于三重态振动能级比单重态的低，即磷光波长总是大于荧光波长。大于荧光波长。0 0S S光光发发射射（低低振振动动能能层层）1 1T T振振动动弛弛豫豫（高高振振动动能能层层）1 1T T系系间间跨跨跃跃1 1S S磷磷2022-5-8二、荧光的激发光谱和发射光谱二、荧光的激发光谱和发射光谱二、荧光的激发光谱和发射光谱二、荧光的激发光谱和发射光谱二、荧光的激发光谱和发射光谱二、荧光的激发光谱和发射光谱荧光：光致发光，照射光波长如何选择？荧光：光致发光，照射光波长如何选择？1.1.荧光的激发光谱（曲线）荧光的激发光谱（曲线）固定发射波长固定发射波长(

12、 (选最大发射波长选最大发射波长),),通过激发单色器扫描，以不同激发通过激发单色器扫描，以不同激发光照射荧光物质，记录荧光强度对光照射荧光物质，记录荧光强度对激发光波长的关系曲线（图中曲线激发光波长的关系曲线（图中曲线I I）。）。激发光谱曲线的最高处，处于激激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，发射的荧光强度发态的分子最多，发射的荧光强度最大。最大。2022-5-82.2.2.2.2.2.荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱( ( ( ( ( (发射光光谱发射光光谱发射光光谱发射光光谱发射光光谱发射光光谱) ) ) ) ) )固定激发光波长和强度固定激发光波长和强度( (

13、选最大选最大激发波长激发波长), ), 通过发射单色器扫通过发射单色器扫描，记录荧光强度与发射光波描，记录荧光强度与发射光波长关系的曲线长关系的曲线( (图中曲线图中曲线II) )。任何荧光都具有两种特征光谱：任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。它们是荧光定性分析的基础。由由于不同物质具不同的特征发射峰于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。鉴别荧光物质。2022-5-83.3.3.3.3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射

14、光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系（1 1）StokesStokes位移位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。（2）发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长能量( (如能级图如能级图l l 2 ,l l 1)，产生不同吸收带，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光动能

15、级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如l l 2 )。 （3）镜像规则）镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。成镜像对称关系。 2022-5-8200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2022-5-8二、二、 荧光产生与分子结构关系荧光产生与分子结构关系1、产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：（1）分子必须具有强的紫外可见吸收结构（内因）；）分子必须具有强的紫外可见吸收结构（内因）；（2）

16、吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光光量子数。即量子效率光光量子数。即量子效率 足够大：足够大：可见，凡是使可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常增加荧光量子产率。通常kF 由分子结构决定（内因），而由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。一般物质的荧光其它参数则由化学环境和结构共同决定。一般物质的荧光量子效率为量子效率为01PECISCICVRkkkkkFFkk吸收的光量子数发射的荧光量子数2022-5-82.2.2.2.2.2.有机化

17、合物分子结构与荧光关系有机化合物分子结构与荧光关系有机化合物分子结构与荧光关系有机化合物分子结构与荧光关系有机化合物分子结构与荧光关系有机化合物分子结构与荧光关系（1）跃迁类型：）跃迁类型： * 的荧光效率高，系间跨越过程的速的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光用，故具有很强的荧光。如荧光

18、素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：给电子基）取代基效应：给电子基如如NH2、OH、OCH3使荧光增强，波长长移；吸使荧光增强，波长长移；吸电子基如电子基如NO2、F、Cl使荧光减弱或熄灭。使荧光减弱或熄灭。2022-5-82022-5-83.3.3.3.3.3.影响荧光强度外部因素影响荧光强度外部因素影响荧光强度外部因素影响荧光强度外部因素影响荧光强度外部因素影响荧光强度外部因素（1）温度：对荧光强度有显著影响）温度：对荧光强度有显著影响。随温度升高荧光强度降。随温度升高荧光强度降低。低。因为内、外转换增加、粘度或因为内、外转换增

19、加、粘度或“刚性刚性”降低）。因此体降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度系降低温度可增加荧光分析灵敏度（2）溶剂：）溶剂：溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变 *及及n * 跃迁的能量）；另外与溶剂作用从而改变荧光物质结跃迁的能量）；另外与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。构来增加或降低荧光强度。（3）酸度：具酸或碱性基团的有机物质，在不同）酸度：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因光物质，因pH值会影响其稳定性，

20、因而也可使其荧光强度发值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。生改变。2022-5-8第十一第十一第十一第十一第十一第十一 章章章章章章 荧光分析法荧光分析法荧光分析法荧光分析法荧光分析法荧光分析法一、荧光强度与浓度关系一、荧光强度与浓度关系二、定量方法二、定量方法第二节第二节第二节第二节第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光定量分析方法荧光定量分析方法2022-5-8一、荧光强度与物质浓度关系一、荧光强度与物质浓度关系一、荧光强度与物质浓度关系一、荧光强度与物质浓度关系一、荧光强度与物质浓度关系一、荧光强度与物质浓度关系 荧光强度荧光强度

21、F正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： F = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) F = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时（浓度很低时（ l c 0.050.05），将括号项近似处理后：），将括号项近似处理后： F = 2.3 I0 l c = KC K荧光系数（与物质性质、荧光系数（与物质性质、激发波长、发射波长、溶剂、温度有关）激发波长、发射波长、溶剂、温度有关）二、定量方法二、定量方法1 1、校正曲线法：用已知量的标准物质经过和试样一样的处理、校正曲线法：用已知量的标

22、准物质经过和试样一样的处理后，后，配制成系列标准溶液，在一定的仪器条件下测定这些配制成系列标准溶液，在一定的仪器条件下测定这些2022-5-8Fci溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同条件下测量未知试强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同条件下测量未知试强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同

23、条件下测量未知试强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同条件下测量未知试强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同条件下测量未知试强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作

24、在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度为基准，将空白溶液的荧光强度为基准，将空白溶液的荧光强度为基准，将空白溶液的荧光强度为基准，将空白溶液的荧光强度为基准，将空白溶液的荧光强度读数调至读数调至读数调至读数调至读数调至读数调至0 0 0，将该标准溶液的，将该标准溶液的，将该标准溶液的，将该标准溶液的，将该标准溶液的，将该标准溶液的荧光强度读数调至荧光强度读数调至荧光强度读数调至荧光强度读数调至荧光强度读数调至荧光强度读数调至100100100或或或或或或505050，然后测定系列中其他标准溶液的然后测定系列中其他标准

25、溶液的然后测定系列中其他标准溶液的然后测定系列中其他标准溶液的然后测定系列中其他标准溶液的然后测定系列中其他标准溶液的荧光强度。所以荧光强度实为相荧光强度。所以荧光强度实为相荧光强度。所以荧光强度实为相荧光强度。所以荧光强度实为相荧光强度。所以荧光强度实为相荧光强度。所以荧光强度实为相对值。对值。对值。对值。对值。对值。2022-5-8注意事项注意事项注意事项注意事项注意事项注意事项（1 1 1）为了使不同时间所测得的标准曲线先后一致，每次绘为了使不同时间所测得的标准曲线先后一致，每次绘为了使不同时间所测得的标准曲线先后一致，每次绘为了使不同时间所测得的标准曲线先后一致，每次绘为了使不同时间所

26、测得的标准曲线先后一致，每次绘为了使不同时间所测得的标准曲线先后一致，每次绘制工作曲线时最好采用同一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁制工作曲线时最好采用同一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁制工作曲线时最好采用同一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁制工作曲线时最好采用同一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁制工作曲线时最好采用同一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁制工作曲线时最好采用同一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁溶液）来校正仪器的读数。（溶液）来校正仪器的读数。（溶液）来校正仪器的读数。（溶液）来校正仪器的读数。（溶液）来校正仪器的读数。（溶液）来校正仪器的读数。（2 2 2）另外，在测量时标准溶液）另外，在测量时标准溶液）另外，在

27、测量时标准溶液）另外，在测量时标准溶液）另外，在测量时标准溶液）另外，在测量时标准溶液和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。理想的或者说真实的空白溶液，原则上应当具有与未知试理想的或者说真实的空白溶液，原则上应当具有与未知试理想的或者说真实的空白溶液，原则上应当具有与未知试理想的或者说真实的空白溶液，原则上应当具有与未知试理想的或者说真

28、实的空白溶液，原则上应当具有与未知试理想的或者说真实的空白溶液，原则上应当具有与未知试样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到的复杂分析体系，很少有可能获得这种真实的空白溶液，的复杂分析体系，很少有可能获得这种真实的空白溶液，的复杂分析体系，很少有可能获得这种真实的空白溶液，的复杂分析体系，很少有可能获得这种真实的空白溶液，的复杂分析体系

29、，很少有可能获得这种真实的空白溶液，的复杂分析体系，很少有可能获得这种真实的空白溶液，在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是溶剂空白。溶剂空白。溶剂空白。溶剂空白。溶剂空白。溶剂空白。2022-5-8它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于

30、不被荧光杂质它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质沾污的荧光化合物的直接测定。（沾污的荧光化合物的直接测定。（沾污的荧光化合物的直接测定。（沾污的荧光化合物的直接测定。（沾污的荧光化合物的直接测定。（沾污的荧光化合物的直接测定。（3 3 3）采用试剂空白则更好）采用试剂空白则更好）采用试剂空白则更好）采用试剂空白则更好）采用试剂空白则更好）采用试剂空白则更好一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样一些，由于试剂空白除含溶剂之

31、外，还含有与标准及试样一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（质

32、所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（4 4 4）但这两）但这两）但这两）但这两）但这两）但这两种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合时候可以通过加入某

33、种化合物于试样溶液中，而这种化合时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于真实的空白溶液。如测真实的空白溶液。如测真实的空白溶液。如测真实的空白溶液。如测真实的空白溶液。如测真实的空白溶液。如

34、测VBVBVB2 2 2时用连二亚硫酸钠时用连二亚硫酸钠时用连二亚硫酸钠时用连二亚硫酸钠时用连二亚硫酸钠时用连二亚硫酸钠NaNaNa2 2 2S S S2 2 2O O O4 4 42022-5-82 2、比较法：如果已知某测定物质的荧光校准曲线浓度的线、比较法：如果已知某测定物质的荧光校准曲线浓度的线性范围，取已知量的荧光物质配成一标准溶液，测定其荧光性范围，取已知量的荧光物质配成一标准溶液，测定其荧光强度。然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由标准强度。然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度的比值求得试样中荧光物溶液的浓度和两个溶液的荧光强度的比值

35、求得试样中荧光物质的含量。质的含量。3 3、联立方程法（多组分）：依据就是荧光强度具有加和性、联立方程法（多组分）：依据就是荧光强度具有加和性（1 1）当混合物中各组分的荧光峰相距颇远、彼此干扰很小）当混合物中各组分的荧光峰相距颇远、彼此干扰很小时，可分别在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度，然时，可分别在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度，然后按单一组分定量方法进行定量。后按单一组分定量方法进行定量。（2 2）若混合物中各组分的荧光峰相近，彼此严重重叠，但）若混合物中各组分的荧光峰相近，彼此严重重叠，但2022-5-8它们激发光谱确有显著的差别，这时可选择不同的激发波长它们激发光谱确有显

36、著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定，然后按单一组分进行定量。进行测定，然后按单一组分进行定量。（3 3）选择两波长时仍无法达到混合物各组分的分别测定，）选择两波长时仍无法达到混合物各组分的分别测定，这时就要进行联和测定，解联立方程而求得。这时就要进行联和测定，解联立方程而求得。例如：硫胺荧的激发峰在例如：硫胺荧的激发峰在385nm385nm，荧光峰在，荧光峰在435nm435nm，吡啶硫胺，吡啶硫胺荧激发峰在荧激发峰在410nm410nm，荧光峰在，荧光峰在480nm480nm，采用，采用385nm或或410nm为激发峰，测定混合物的试样溶液在为激发峰，测定混合物的试样溶液在435nm

37、和和480nm的荧的荧光强度光强度F，然后由所测出的混合物的荧光强度及事先测定的，然后由所测出的混合物的荧光强度及事先测定的硫胺荧和吡啶硫胺荧在上述的激发波长和发射波长下的相应硫胺荧和吡啶硫胺荧在上述的激发波长和发射波长下的相应荧光系数而列出下列方程。荧光系数而列出下列方程。2022-5-8假设选择假设选择385nm作为激发波长作为激发波长例题：利用连二亚硫酸钠可熄灭核黄色发出的荧光来测定奶例题：利用连二亚硫酸钠可熄灭核黄色发出的荧光来测定奶粉中的维生素粉中的维生素含量。精确称取含量。精确称取0.5000g奶粉，加奶粉，加pH=4.6的的HAcNaAc缓冲液沉淀蛋白质，移入缓冲液沉淀蛋白质，移

38、入50ml溶量瓶中，加溶量瓶中，加水至刻线，摇匀，过滤，取滤液测得荧光强度水至刻线，摇匀，过滤，取滤液测得荧光强度Fx=28.5，取，取出比色皿加入少量的连二亚硫酸钠，迅速摇匀使维生素出比色皿加入少量的连二亚硫酸钠，迅速摇匀使维生素B2吡啶硫胺荧吡啶硫胺荧硫胺荧硫胺荧吡啶硫胺荧吡啶硫胺荧硫胺荧硫胺荧CKCKFCKCKF385/480385/480385/480385/435385/435385/4352022-5-8荧光熄灭，立即再测荧光强度为荧光熄灭，立即再测荧光强度为F Fo o=6.20=6.20。在另一比色皿中。在另一比色皿中加入加入24ml24ml被测维生素被测维生素B B2 2溶液

39、后再加入浓度为溶液后再加入浓度为0.25000.2500g/mlg/ml维维生素生素B B2 2标准溶液标准溶液1ml1ml，测得荧光强度为，测得荧光强度为F=48.6F=48.6。计算奶粉中。计算奶粉中维生素维生素B B2 2的含量的含量 解：选用比较法，设含量为解：选用比较法，设含量为C CX X（g/mlg/ml） 28.5-6.20=K 28.5-6.20=K CX 48.6-6.20=K(Cx+C C)=K(Cx+10.2500/25) Cx= 0 . 0 111 g / m l ， 则 奶 粉 中 维 生 素， 则 奶 粉 中 维 生 素 B2含 量 为含 量 为 0.011150

40、/0.5000=0.2775 g/g2022-5-8三、荧光分析法的应用三、荧光分析法的应用三、荧光分析法的应用三、荧光分析法的应用三、荧光分析法的应用三、荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀