我国药用植物次生代谢产物功能基因研究概况

1、【摘要】综述了近年来我国药用植物次生代谢产物功能基因的研究方法和内容，着重介绍了萜类、黄酮类、生物碱类、酚类、多糖类、凝集素等次生代谢产物合成相关功能基因的研究现状，对药用植物次生代谢产物合成相关功能基因的应用前景作了介绍，为今后药用植物功能基因的大规模研究和利用提供借鉴。【关键词】药用植物次生代谢产物功能基因1995年生物学家提出“后基因组(postgenome)”的概念，即在基因组静态的作图、碱基序列分析基础上转入对基因组动态的生物学功能的研究。随着人类基因组计划(hgp)的顺利进行,基因组学的研究从结构基因组学(strueturalgenomics)开始过渡到功能基因组学(functio

2、nalgenomics),结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨遗传、物理图谱为主；功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息，发展和应用新的实验手段系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法及统计和计算机分析为特征。目前人类、酵母的功能基因组研究已全面展开，植物的功能基因组研究起步较晚，现正处于结构基因组学和功能基因组学并重的时代，但近几年植物功能基因组学研究得到了迅速发展13。1 药用植物次生代谢产物合成相关功能基因组学研究方法植物在长期进化过程中，逐渐形成了一些适应环境的生理生态功能,其中之一就是根据初生生长的需要产生各种类型的次生代谢产物。次生

3、代谢产物是植物在长期进化中与其生存环境相互作用的结果,既能够在植物体内积累，抵御病原微生物等的侵害，又在植物的整个代谢活动中占有重要地位4。药用植物功能基因研究是从功能基因入手阐明药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，其中主要涉及到次生代谢产物生物调控的关键酶系的结构编码基因和其他功能基因。研究中可能应用的分子生物技术有植物的表达序列标签(est)和cdna文库筛选；药用植物功能蛋白质组研究;特定代谢时期细胞功能簇(crc)分析和功能蛋白质组表达图谱用于基因组功能提示的可行性；基因表达指纹(gef)；基因表达系统分析(sage)；cdna3端限制酶切片段显示；分子指数的rna指纹(mi)

4、；消减杂交(ssh)；基因芯片等。这些分子生物技术可应用于药用植物次生代谢调控机制研究，功能基因和次生代谢酶基因的克隆、表达和鉴定等5。2 药用植物次生代谢产物相关功能基因组研究概况2.1萜类物质萜类化合物(terpenoid)是一类由异戊二烯(soprene)为结构组成单元的天然烃类化合物的统称，在自然界中分布广泛、种类繁多、结构多样。迄今为止大约有22000种萜及萜类衍生物的化学结构已被鉴定，它们不仅在植物的生命活动中扮演重要的作用，而且还被广泛地应用于工业、医药卫生等领域6。肖明贵等】7从曼地亚红豆杉中提取分离出mrna，然后根据已知植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(ggpps基因

5、)dna序列保守区设计特异简并引物。rt-per获得了一条大小约600bp的扩增谱带，回收该特异谱带并进行ta克隆，发现该序列属于ggpp合成酶的片断，与加拿大红豆杉和北美冷杉的ggpp合成酶相应区段的氨基酸序列一致性为98%和86%。蛋白质序列分析发现该序列含有一个特征的异戊二烯合成酶保守的结构域。进化树分析表明，曼地亚红豆杉ggpps在进化上位于植物类，靠近古细菌类。冯磊中国红豆杉紫杉烷13a-羟基化酶基因的克隆及表达曲阜师范大学2006硕士研究生学位论文)从中国红豆杉中克隆得到紫杉烷13a-羟基化酶基因序列，长为1848bp,阅读框(orf)编码区为1458bp，编码485个氨基酸，分子

6、量54.7kd，该基因与东北红豆杉紫杉烷13a-羟基化酶有97%的相似性。与其他已克隆的红豆杉羟基化酶有54%60%的相似性。该基因编码一膜锚定蛋白，推断所克隆基因编码一个执行生物合成功能的a类p450蛋白。周明兵等8以杜仲树叶总rna为模板扩增出杜仲法呢基焦磷酸合酶基因(farnesylpyrophasphatesynthase,eufps),cdna序列全长1271bp,开放阅读框共编码320个氨基酸残基，其核酸序列与拟南芥、银胶菊和巴西橡胶树fpp合酶的序列同源性分别为81%,87%和82%。刘彦(青蒿生物合成相关基因的克隆、大肠杆菌表达与分子分析.中国科学院研究生院2006博士学位论文

7、)从青蒿高产株系001中克隆出全长1886bp的倍半萜合酶cdna，其氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、蕊若岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为39%,38%和41%；与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆casc125的一致性为50%，48%和59%。克隆了一个1539bp全长鲨烯合酶cdna，青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70%，77%，44%，39%。赵玉军等9从青蒿高产株系025中的cdna文库中克隆到了一个编码青蒿法呢基焦磷酸合酶(aafps1)的cdna(af1),序列分析表明，这一cdna编码一个含343个氨基酸残

8、基的蛋白质，分子量为39kd，推导出的氨基酸序列与来自其他植物、哺乳动物和酵母的fps相似，也包含异戊烯基转移酶和聚异戊烯基合酶所共有的5个保守域，此cdna在大肠杆菌中的表达产物表现出明显的fps酶学活性。刘水平等1012从人参根组织中分离总rna，使用rt-per扩增出人参皂苷生物合成相关基因gbr6开放阅读框(orf)cdna片断，并将其定向克隆入原核高效表达载体pqe30,阳性克隆经bam1和pst1双酶切鉴定、测序验证与已知的gbr6orf序列完全一致，成功构建了pqe30-gbr6orf融合原核表达载体。陈莉(三七主要有效成分三萜皂苷合成关键酶fps基因的克隆及序列分析.广西医科大

9、学2005硕士研究生学位论文)对三七三萜皂苷合成关键酶法呢基焦磷酸合酶(fps)的基因进行克隆，cdna序列全长1409bp,开放阅读框共编码343个氨基酸残基，氨基酸序列与积雪草、银胶菊、青篙、山艾树的fps氨基酸序列的同源性分别为95%，87%，86%和86%，核酸序列同源性则分别为81%，66%，68%和66%。陈珅(三七三萜皂苷合成途径鲨烯环氧酶基因的克隆及初步表达.广西医科大学2006硕士研究生学位论文)对三七三萜皂苷合成关键酶鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase，se)的基因进行了克隆，cdna序列长1648bp，分子量约为64kd，开放阅读框共编码537个氨基酸残基，氨

10、基酸序列与人参、管状苜蓿、毛曼陀罗、亚洲栽培稻、番茄、拟南芥和甘蓝型油菜的同源性分别为97%，76%，73%，71%，70%，70%和45%；核酸序列的同源性分别为97%，63%，62%，62%，62%，60%和48%。朱华(三七鲨烯合酶基因的克隆及其功能的初步研究.广西医科大学2006硕士研究生学位论文)对三七鲨烯合酶(ss)基因及3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)基因进行体外克隆，cdna序列全长1270bp，开放读码框共编码415个氨基酸残基，氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥、水稻的ss氨基酸序列的同源性分别为98%，89%，81%，78%，71%，核苷酸序列的同源性分别为98%，

11、88%，77%,73%，66%。获得了三七gapdh基因的部分cdna序列，长627bp，与拟南芥、烟草、人参的gapdh氨基酸序列的同源性分别为91%，93%，95%。核苷酸序列的同源性分别为82%，84%，85%。杜鹃蹄叶橐吾萜类化合物合成相关基因克隆及功能研究.吉林大学2007博士学位论文)从野生蹄叶橐吾中克隆出萜类化合物紫菀酮形成关键酶hmg-coa还原酶家族(hmgr、hmgr2)，成功构建了hmgr基因植物双元高效表达载体pbshmgr，获得了转化效率极高的转基因蹄叶橐吾植株。转基因植株及其野生型对照蹄叶橐吾紫菀酮含量hplc测定结果表明，hmgr基因的超表达增加了紫菀酮在转基因植

12、株根、茎中的积累。刘长军等13从亚洲棉中分离得到倍半萜棉毒素合成相关酶法呢基焦磷酸合成酶(fps)的cdna。序列分析表明，该cdna全长1280bp，开放阅读框共编码342个氨基酸残基，分子量为39kd，氨基酸顺序与拟南芥和青蒿的fpp合酶序列同源性为78.9%和80.7%。2.2黄酮类物质黄酮类化合物是植物在长期的生态适应过程中为抵御恶劣生态条件、动物、微生物等攻击而形成的一大类次生代谢产物。它们是广泛分布于植物界的碳基本骨架化合物，在许多植物的花、果和叶中大量分布，目前发现的四千余种的黄酮类化合物可以分为以下几种：黄酮醇(flavonols)、黄酮(flavones)、异黄酮(isofl

13、avones)和花色素苷(anthocyanins)14。程水源等15从银杏叶中克隆得到了控制银杏叶中黄酮类化合物代谢途径中关键酶苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammo-niaTyase,pal)基因的部分序列，长度862bp，氨基酸序列与长白松、海岸松、火炬松和亮石杉pal基因的氨基酸同源性分别为93%,93%,91%和90%。southern杂交结果表明银杏pal是一个多基因家族。崔光红等16研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱，将45,60d丹参毛状根分别与30d材料进行杂交，得到203个差异基因。测序后得到172条est,拼接聚类后形成114个unigene,其中功能已知基因

14、62个。得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素p450、二萜合酶等基因片段。蔡文伟(海南龙血树血竭生物合成相关基因的分离.华南热带农业大学2006硕士学位研究生论文)以经诱导物诱导处理刚产生血竭和未经诱导物处理的海南龙血树组培苗为材料，利用抑制消减杂交(ssh)技术构建了龙血树血竭生物合成相关基因的差减cdna文库，分离到与信号转导相关的cdna片段5个，转录翻译相关蛋白cdna片段5个，物质能量代谢酶类cdna片段12个。段小瑜等17从大豆总rna中分离了合成异黄酮的关键酶异黄酮合酶(isoflavonesynthase,ifs)基因，含1583个核苷酸，与已报道的大豆异黄酮合酶基因的核苷酸同

15、源性为92%。杨丽(百合查尔酮合成酶基因(chs)及其启动子的克隆与分析西北农林科技大学2006硕士学位论文)从东方百合的花瓣组织rna中克隆出查尔酮合成酶基因(chs)，长度约900bp的目的片段，与已发表的百合中chs基因的同源性达到91%以上。在获得chscdna序列的基础上，重新设计chs基因的引物，以基因组dna为模板进行pcr扩增，获得了大约1300bp的目的片段，chs基因dna序列包含两个外显子和1个内含子。通过接头连接pcr，克隆了约898bp的百合chs基因的上游调控序列。黄艳岚(马铃薯花青素转录激活基因的克隆与序列分析.华南热带农业大学2006硕士学位论文)从紫色马铃薯紫皮rna中扩增了花青素转录激活基因myc的保守区域片段(stmyc1),长度为1106bp，具有完整的编码阅读框，编码区为10-990bp，共编码326个氨基酸，与