微生物实验 2

1、微生物学实验微生物学实验 王王 慧慧 利利实验室规则实验室规则 带证件，物品在抽屉，实验室穿工作服 实验室内不准饮食、吸烟 离实验室前应将双手刷洗干净 值日生应使实验室恢复原貌 将观察后的培养物送消毒室处理 实验评分标准及实验报告实验评分标准及实验报告 实验20%：平时及实验报告10、技能考试10 实验报告：目的、原理、步骤、注意事项、结果及分析、思考题 实验报告：一般7.5-9.5，迟交7，订两本 实验报告应翔实、认真 实验技能考试：四区划线、革兰染色、油镜实验一实验一 无菌操作、细菌接种（斜面、液体、无菌操作、细菌接种（斜面、液体、半固体和平板）半固体和平板）一、实验目的一、实验目的 1、

2、混杂微生物分离纯化。 2、各种培养基上接种、移植和培养 3、无菌操作技术。 4、细菌在培养基上生长现象及菌落形态描述 5、细菌人工培养条件和培养方法 二、实验原理二、实验原理 1、无菌技术-在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染，同时也防止其污染环境的操作技术称为无菌技术。 2、微生物需要一定的条件下生长（培养基、培养温度和时间等）三、实验内容三、实验内容 接种工具准备 无菌操作技术 斜面接种、液体接种、半固体穿刺接种和平板分区划线接种 三、实验材料和用具三、实验材料和用具 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）18-24h斜面培养物 1支 金黄色葡萄球菌（Staph

3、ylococcus aureus）18-24h斜面培养物 1支 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌18-24h肉汤培养物混合菌液 1支 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂平板平板培养基 2个/人 牛肉膏蛋白胨液体液体培养基（肉膏汤） 2支/人 牛肉膏蛋白胨固体斜面斜面培养基 2支/人 半固体半固体牛肉膏蛋白胨高层培养基 2支/人无菌技术无菌技术 无菌室：紫外灯3060min ， 空气消毒 接种、倒平板：无菌室、超净工作台或酒精灯火焰 接种环针：用前后均需采用火焰灭菌 打开或关闭无菌试管和烧瓶：管口通过火焰23 次，开启后尽量靠近火焰。不可使含菌材料污染台面和其它物体 物品：应严格消毒, 使用中不得与未经灭菌的物

4、品接触。 工作完毕：无菌室内用紫外灯照射3Omin，人员消毒洗手。 因不慎造成污染时 , 应及时用消毒液处理 四、实验方法四、实验方法 接种环的制作 接种环系采用一段长约4-5cm硬度适中的镍合金丝。环要求闭合以蘸取液体满环为准 标记：姓名（学号）、菌种 平板分区划线：肉汤混合菌种 斜面接种法：针 、环各一支 肉汤管接种法 ：液、固各一支 半固体穿刺接种法 ：斜面、平板各一支 接种工具及灭菌 琼脂平板四区划线法 示教培养 接种后，37培养16-18h, 观察并记录 实验结束，各组菌种上交实验结果实验结果 平板分区划线：注意34区是否有两种单个菌落，观察并描述分离的单个菌落的特征 斜面：生长旺盛

5、的程度及表面有无菌苔生长 肉汤：表面-菌膜，液体中-混浊及色素，底部-沉淀 半固体：有动力的穿刺线模糊或整个半固体混浊。 细细菌菌的的培培养养特特征征 色 素斜面培养基生长丝状扩散状液 体 培 养 基 生 长 沉 淀 菌 膜、浑浊半 固 体 生 长 动力观察实验报告用实验报告纸书写实验报告 （实验内容题目）1、实验目的：2、实验原理3、实验方法与步骤4、实验结果分析5、注意事项6、思考题：将实验指导书实验二 细菌的简单染色、显微镜使用 一、实验目的一、实验目的 普通光学显微镜油镜的使用和保养方法 微生物的涂片、简单染色的操作 细菌菌落的形态观察二、实验原理二、实验原理 菌落形态特征表述：大小、

6、形态、颜色、质地、表面、透明度、隆起、边缘、气味。 细菌菌体染色：菌体细胞小、无色半透明，在显微镜下菌体与背景反差小，不易观察，通过染色，色素的沉着，反衬出菌体的形态。 光学显微镜的放大原理：物象的清晰度取决与放大倍数和显微镜的分辨率。分辨率是指显微镜能辨别物体最小间隔的能力。 分辨率（R）=0.61/NA; NA(数值口径)=nsin/2; 为镜口角，最大值为180，n为物镜与 标本之间介质的折射率。香柏油n=1.51，载玻片的n=1.52，几乎不发生折射。三、实验内容三、实验内容 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌涂片 石炭酸复红染液、吕氏美蓝染液对涂片单染 无菌操作技术、接种环使用

7、油镜观察四、实验材料四、实验材料 1、涂片染色用菌种 金葡（Staphylococcus aureus ）斜面2支/组 大肠（Escherichia coli ） 斜面2支/组 液1支/组 枯草（Bacillus subtilis） 斜面2支/组 2、染色液 石炭酸复红染液、吕氏美蓝染液五、实验方法五、实验方法 涂片：涂片：载玻片-标记-一小环生理盐水（液体不加，菌液一环），-接种环取菌落少许-与生理盐水混匀，涂布成直径约10mm的均匀薄膜-将接种环烧灼灭菌 干燥：干燥：室温自然干燥。或标本面向上，在远火高处略加温。切勿紧靠火焰或时间过长，以免标本烤枯而变形 固定：固定：杀死细菌，改变对染料的

8、通透性，凝固细胞质和其他细胞结构，使菌体与玻片粘附得较牢，在染色时不致被染液和水冲掉。手托玻片一端，标本面向上，在酒精灯焰上快速来回通过三次 染色：染色：在已固定片上滴染液，染1分钟水洗：水洗：用细流水（自来水水流缓慢顺着指甲或用洗液瓶）轻轻冲洗，并将玻片上残留水份轻甩净。干燥：干燥：吸水纸吸去载玻片上的水 镜检镜检：加一滴香柏油油镜检查，注意观察菌体的形态和染色性 五、实验结果五、实验结果 绘制在油镜下观察的微生物形态 注明物镜的放大倍数和总放大倍数 六、注意事项六、注意事项 1、涂片要均匀，切忌太厚。2、图片后的接种环要灭菌-无菌操作3固定时，不能离火焰太近，以免烤枯而变形4、不要让染料沾

9、到地面、手指、实验服等上。5、注意油镜的使用和保养 ：显微镜的放置-调节光源-放置标本-找合适的视野-加香柏油-调焦使用后的油镜处理-镜台下降-取出标本-清洁油镜-清洁目镜-清洁标本-防治显微镜（）八字形，下降镜台）常用染色法 单染色法单染色法：用一种染料使细菌着色，如用美蓝或稀释石炭酸复红等，只能观察细菌的形态和大小，但不能鉴别细菌复染色法复染色法：用二种以上染料染色的方法，此法除显示细菌形态大小外，还有鉴别细菌种类的价值。细菌学中最广泛使用的复染色法是革兰染色法还有抗酸染色法特殊结构染色法特殊结构染色法：细菌的某些结构，如：鞭毛、荚膜、细胞壁、芽胞及异染颗粒等，用普通染色法不易着色，故需用

10、特殊染色法。这些染色法不仅能使特殊结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察荧光染色法荧光染色法：细菌用荧光染料着色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。此法有加快检查速度和提高阳性率等优点负染色法负染色法：是指背景着色而细菌本身不着色。常用有墨汁，也可用刚果红或水溶性苯胺黑等，因酸性染料带负电，故菌体不着色，只能使背景着色。实践中可用墨汁负染色法检查新型隐球菌的荚膜。背景呈黑色，荚膜不着色，包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。实验报告用实验报告纸书写实验报告 （实验内容题目）1、实验目的：2、实验原理3、实验方法与步骤4、实验结果分析5、注意事项6、思考题

11、：将实验指导书p23，p27实验三 革兰氏染色法、动力（悬滴、压滴）一、实验目的实验目的 革兰染色的基本原理和方法 细菌不染色标本在普通显微镜下的动力观察 细菌压滴片和悬滴片的制作方法 二、实验原理实验原理 主要根据革兰氏阴性细菌G-和 革兰氏阳性菌G+由于细胞壁结构及化学成分的差异而引起的物理特性（脱色能力的不同)的不同，而表现出不同的染色效果。结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染涂片固定革兰氏染色法（革兰氏染色法（Gram Stain）由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。结果: 阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红红色色三、实验内容三、实验内容 1、金葡、枯草、

12、大肠杆菌涂片 2、涂片革兰染色，镜检观察，区别革兰阴性菌和阳性菌 3、用无菌操作制压滴片、悬滴片 ，高倍镜、暗视野观察 三、实验材料三、实验材料 革兰染色用的菌种金葡 （Staphylococcus aureus ） 1824小时平板平板大肠（Escherichia coli ） 1824小时平板平板枯草（Bacillus subtilis） 5日枯草平板平板粪链(Streptococcus faecalis) 1824小时液体液体革兰染色液。 革兰液（结晶紫染液） 革兰液（95%酒精）革兰液（卢戈碘液） 革兰液（稀释石炭酸复红染液）制作压滴片、悬滴片菌种普通变形（Psoteus Vulgar

13、is） 1824h液体液体铜绿假单胞（Pseudomonas aeruginosa） 1824h液体液体四、实验方法四、实验方法 革兰染色: 涂片干燥（自然干燥或借助火焰）固定（外焰2-3S/2-3次）结晶紫结晶紫初染（1min）细水流冲洗（沥干细水流冲洗（沥干水）水） 卢氏碘液卢氏碘液媒染（1min) 细水流冲洗（沥干水）细水流冲洗（沥干水）95%95%酒精酒精脱色（30s-1min）细水流冲洗（沥干水）细水流冲洗（沥干水） 石碳酸复红石碳酸复红复染（1min）水洗干燥镜检 染色时间：1，1、半，1标记！ 1cm2 压滴法: 将细菌悬液滴于载玻片中央，加上盖玻片，置于显微镜下观察。此法是研究

14、微生物形态最简单、最基本的方法之一。悬滴法悬滴法: : 将细菌悬液于盖玻片中央，翻转，置于凹玻片的凹窝中央，由于细菌不受盖玻片的压力影响，所以，此法常用于观察并区别细菌运动的方式，也可观察细菌的繁殖方式，及孢子萌发等。可利用暗视野显微镜或相差显微镜形成黑暗背景、被检物构成亮点（小黑点）（小黑点）的特性进行细菌运动方式的观察 五、实验结果五、实验结果 蓝紫色：革兰阳性菌 紫红色：革兰阴性菌 有鞭毛的细菌为真正运动，无鞭毛的细菌则为分子运动 （热运动）与分子的布朗运动的区别。 六、注意事项六、注意事项 1、涂片要均匀，切忌太厚。2、图片后的接种环要灭菌-无菌操作3固定时，不能离火焰太近，以免烤枯而

15、变形4、不要让染料沾到地面、手指、实验服等上。5、酒精脱色是关键的一步；6、菌龄也会影响染色结果；7、压片法注意产生气泡、悬滴法避免液滴破散8、分辨细菌的真正运动与布朗运动9、严格的无菌操作。实验报告用实验报告纸书写实验报告 （实验内容题目）1、实验目的：2、实验原理3、实验方法与步骤4、实验结果5、注意事项6、思考题：将实验指导书p30实验四 理化因素对细菌的影响一、实验目的一、实验目的 了解抑制或杀死微生物的一些物理、化学因素的作用原理和方法 了解芽孢在消毒作用中的重要性。 了解紫外线对细菌的作用，了解某些染料和消毒剂的抑菌作用。 了解利用物理因素（热力）对细菌的作用。 掌握几种消毒剂的常

16、用工作浓度。 二、实验原理二、实验原理 微生物生长受环境条件的制约，不同的物理化学因子对微生物的作用机制不同（包括紫外线、热力，化学消毒剂、结晶紫，过滤除菌)。 三、实验内容三、实验内容 1、比较三种细菌（大肠杆菌、枯草芽胞杆菌，表皮葡萄球菌）对紫外线的抵抗力。 2、比较同一细菌在不同温度（60、100、121）的抵抗力。 3、比较三种细菌在相同温度的抵抗力。 4、比较不同化学消毒剂对同一细菌的作用（室温）。 5、比较同一消毒剂对三种细菌的作用（室温）。 6、比较不同浓度结晶紫染料对三种细菌的抑制作用。 7、验证滤菌器的除菌作用。四、实验材料四、实验材料 1、菌种：临用前用无菌试管分装 枯草芽

17、孢杆菌（Bacillus subtilis） 肉汤8支/组 大肠杆菌（Escherichia coli ）： 肉汤8支/组 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）肉汤8支/组 2、培养基：普通肉汤管21支， 普通琼脂平板4块，1:1000和1：5000结晶紫琼脂平板各一块 3、浸有各种药品的小圆滤纸片： 3%过氧化氢、5%石炭酸、70%酒精、5%洗洁精、5%来苏尔、0.1%新洁尔灭 五、实验方法五、实验方法 1、紫外线： 平板一块，皿底标记 无菌的棉签无菌的棉签- -肉汤菌种肉汤菌种- -浸润浸润- -在管壁稍挤在管壁稍挤- -平平板表面密集涂布板表面密集涂布-

18、-棉签入消毒缸棉签入消毒缸 再移至无菌室内，打开皿盖，将自行设计的各种形状白纸放置于平板上，在距离紫外灯紫外灯30cm30cm处照射处照射20min20min，去纸在酒精灯上烧灼，灭火后将纸灰丢进废物缸。 盖上平皿盖，于 37温箱中倒置培养培养1824小时，观察结果。2、热力不同热力方式对细菌的作用a）分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌菌液各各4 4管管，作好标记，3管进行如下处理：高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌121.3121.3，20min20min；沸水浴，；沸水浴，1min1min，5min5min，30min30min；6060，60min60min。另一管作为对照一管作为对照，不

19、做热处理。b）处理完毕后，用棉签蘸取菌液，涂布平板，涂布平板，作好标记标记。注意阴性、阳性对照。c）于 37温箱中，培养1824小时，观察结果。煮沸与作用时间的关系a）分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌菌液各各3 3管管，作好标记，放入沸水浴中。b）1min1min后，各取出后，各取出1 1管管，从每管中棉签蘸取少许，分别接种平板接种平板，作好标记。c）5min5min后，再各取出后，再各取出1 1管管，从每管中棉签蘸取少许，分别接种平板接种平板，作好标记。d）30min30min后后，将沸水浴中剩余的3支培养物取出，棉签蘸取少许，涂布平板e）于 37温箱中，培养1824小时，观察结果

20、。3、化学消毒剂对细菌的作用 平板一块，皿底标记。将皿底划成6等份，每份及圆心内标明一种药物名称。棉签伸入肉汤菌种中浸润，在管壁上稍挤。将浸菌的棉签在平板表面密集涂布，将棉签放入消毒缸中。无菌镊子将浸有药品的圆滤纸片（打孔器打好）取出，在管壁上沥去多余药液，无菌操作将纸片对号放入培养皿的各个小区内。轻轻按压轻轻按压。将放好滤纸片的含菌培养皿倒置倒置于37温箱中，培养1824小时。测定抑菌圈大小抑菌圈大小，记录实验结果，并说明其杀菌能力的强弱。纸片分布4、结晶紫的抑菌作用 将含结晶紫的琼脂平板一分为三，作好标记。 取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌各一接种环菌液分别涂布于平板表面相应的位置上

21、 37培养1824小时，观察结果。大肠杆菌枯草杆菌表皮葡萄球菌5、细菌的滤过除菌 用无菌注射器抽取1ml菌液，注入无菌滤器内，加压过滤加压过滤，用1支无菌肉汤管接滤过的液体。做好标记 取未过滤的培养物，接入肉汤管中 37培养1824小时，作为生长对照。 实验结果：1、描述紫外线处理所观察的实验结果；2、列表调查结果六、注意事项六、注意事项 1、弄清楚各项实验的目的。2、分装个种菌种，热处理后再接菌，而不是接菌后处理。实验报告用实验报告纸书写实验报告 （实验内容题目）1、实验目的：2、实验原理3、实验方法与步骤4、实验结果5、注意事项6、思考题：将实验指导书p55实验补充内容（一）紫外线杀菌机制

22、与特征1、紫外线诱导胸腺嘧啶二聚体形成和DNA结构的交联，从而抑制复制2、紫外线辐射是空气中的O2-O-+O2-O3-或者H2O+O2-H2O2特点：直线传播，并被不同的表面反射 穿透力差，普通玻璃可吸收紫外线（二）消毒剂的杀菌和抑菌机制消毒剂：能迅速杀灭病原微生物的药物称防腐剂：能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物称为机制：1、使细胞膜通透性改变 2、使菌体蛋白变性和凝固，失去生物活性。 3、破坏或改变蛋白和核酸功能基团、使酶蛋白失活。 紫外线的作用（1）紫外线的作用（2） 消 毒 剂 的 作 用 效 果 观 察实验五 细菌的生理、生化反应一、实验目的一、实验目的 认识染色方法鉴别细菌的局限性。

23、 学习了解常用几个生理生化反应原理、方法和结果判断。 不同细菌IMViC实验结果的观察 二、实验内容二、实验内容 O-F实验 KIA IMViC(4种) 硫化氢试验 尿素三、实验材料三、实验材料 1、菌种大肠杆菌（Escherichia coli ） 斜面 普通变形杆菌（Psoteus Vulgaris） 斜面 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 斜面 产气杆菌 （Enterobacter aerogenes） 斜面 2、培养基O-F发酵管、KIA、蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、H2S试验用培养基、尿素培养基3、试剂甲基红试剂 1瓶/组V

24、-P试剂 液：5%萘酚 1瓶/组 液：40% KOH 1瓶/组 吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛） 1瓶/组无菌液体石蜡 1瓶/组四、实验原理四、实验原理 原理：各种细菌具有不同的酶系统，可利用的底物不同，代谢产物也不同，与一定的试剂发生生化反应，显示出的现象不同。所以被用来进行细菌的分类与鉴定。生化反应的原理 1、O-F试验-检查细菌的代谢类型检查细菌的代谢类型。氧化型：细菌分解葡萄糖，必须有氧，无氧不分解。专性需氧菌。发酵型：分解葡萄糖可无氧降解。有氧或无氧均可。兼性厌氧菌。不分解葡萄糖的细菌，称为产碱型或不分解糖型。2、KIA-用于观察细菌对葡萄糖、乳糖分解情况用于观察细菌对葡萄糖、乳糖分解情

25、况。细菌分解葡萄糖、乳糖分解葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色斜面与底层均呈黄色，且有气泡。只分解葡萄糖而不分解乳糖只分解葡萄糖而不分解乳糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但葡萄糖含量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部斜面部分又变成红色分又变成红色，底层底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色保持黄色。细菌产生H2S时与培养基中硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁黑色的硫化铁。 3、硫化氢试验：检查细菌能否分解含硫的氨基酸或化合检查细菌能否分解含硫的氨基酸或化合物物 有机物，如胱氨

26、酸、半胱氨酸和甲硫氨酸产生硫化氢（H2S） H2S遇重金属盐类（如铅盐或铁盐等）则形成黑色黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物4、尿素-检查细菌能否产生尿素酶，放检查细菌能否产生尿素酶，放NH3,PHNH3,PH升高升高 尿素酶分解尿素释放出氨 尿素琼脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚红酚红。酚红在pH6.8时为黄色黄色，而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养基的pH升高，在pH升至8.4时，指示剂就转变为深玫瑰红色深玫瑰红色IMViC 吲哚试验（Indol test）：检查细菌是否含有色氨酸酶检查细菌是否含有色氨酸酶 细菌含色氨酸酶，分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就

27、会形成玫瑰吲哚，此为红色化合物红色化合物, ,否则阴性否则阴性。大肠杆菌此反应阳性，产气杆菌阴性反应。甲基红试验（Methyred test）：检验细菌的糖代谢。检验细菌的糖代谢。 细菌将糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基变酸。甲基红指示剂甲基红指示剂pH4.2(pH4.2(红色红色) )6.36.3（黄色）（黄色），可使培养基由原来的橘黄色变为红色，即甲基红试验阳性反应，否则阴性。大肠杆菌阳性反应，产气杆菌阴性反应。伏-普试验（vogesprokauer test）：检验细菌的糖代谢检验细菌的糖代谢 细菌利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此

28、物在碱性条件下被空气中的氧气化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用生产红色化合物，即伏普试验阳性反应红色化合物，即伏普试验阳性反应，无红色化合物产生为阴性。柠檬酸盐试验（citrate test）：检查细菌能否利用柠檬酸盐为唯一碳源检查细菌能否利用柠檬酸盐为唯一碳源。 细菌在分解柠檬酸钠盐及培养基种的磷酸铵后，产生碱性碱性化合物，使培养基的pH值升高，在有1 1溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为由绿色变为深兰色，为阳性，否则为阴性深兰色，为阳性，否则为阴性。指示剂的指示范围为：pH值小于6.0时呈黄色，pH值为6.07.6时为绿色。五、实验方法五、实验方法 接种方法

29、：用接种针接种针，不用接种环。避免使培养基开裂造成假性产气和影响动力观察生化管用试管装，标记在试管上生化管用试管装，标记在试管上每人做一株菌每人做一株菌 硫化氢试验取H2S试验用培养基（内含有柠檬酸铁铵），穿刺接种穿刺接种，在试管上注明菌名，置37恒温培养1824h，培养后取出观察，有黑色沉淀产生为阳性有黑色沉淀产生为阳性尿素分解取尿素培养基，用记号笔标明各管欲接种的菌名。穿刺接种穿刺接种。将接种后的试管置35中，培养2448h 红色为阳性红色为阳性将取有试验菌的接种针在KIA斜面自下而上划一条线划一条线，再直刺直刺入KIA的高层退回，然后在斜面上连续划线斜面上连续划线。 生长现象 结果判断

30、记录方法 高层黄色 利用葡萄糖产酸 斜面红色 不利用乳糖 K/A； -/+高层黄色 利用葡萄糖产酸斜面黄色 利用乳糖产酸 A/A； +/+高层黄色并有气泡 利用葡萄糖产酸产气斜面红色 不利用乳糖 K/AG； -/高层黄色并有气泡 利用葡萄糖产酸产气斜面黄色 利用乳糖产酸 A/AG； +/高层红色不变 不利用葡萄糖斜面红色 不利用乳糖 K/ K； -/-底部、高层或整管黑色 产硫化氢 H2S+；H2SKIA 试验O-F试验 接种 a)用接种针将菌穿刺接种到2 2支支O-F管中。 b）在其中1支管中加入无菌液体石蜡无菌液体石蜡，厚度达1cm1cm以上。 开口管 加石蜡管 结果 绿色黄色 绿色黄色

31、发酵型（F） 绿色黄色 绿色不变 氧化型（O）绿色蓝色（或不变） 绿色不变 产碱型(不分解糖型)I-吲哚试验取蛋白胨水蛋白胨水培养基试管，穿刺接种穿刺接种。培养后加入吲哚试剂（对二甲氨基苯甲醛）2d2d ，液面出现红色环红色环为阳性为阳性。加入试剂后不可再摇动不可再摇动，否则被混合，红色不明显 M-甲基红试验取葡萄糖蛋白胨水（葡萄糖蛋白胨水（葡磷葡磷）培养基，分别接种大肠杆菌、产气杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌，置37恒温培养1824h。培养后沿管壁加入甲基红指示剂1d,1d,振动混匀振动混匀,上层呈现红色为阳红色为阳性性。Vi-伏普试验取葡萄糖蛋白胨水（葡磷）葡萄糖蛋白胨水（葡磷）培养基，

32、穿刺接种穿刺接种。培养后，加入5%萘酚溶液3 35d5d，然后加入1 12d2d的40%KOH，颠倒混匀颠倒混匀，37 1530min。呈红色者，为伏红色者，为伏- -普反应阳性普反应阳性。 C-柠檬酸盐试验取柠檬酸盐斜面，穿刺接种穿刺接种，置37恒温培养48h后观察，培养基颜色由绿色变为深蓝色者为阳性绿色变为深蓝色者为阳性，不变为阴性 实验结果实验结果 阳性结果以“+”，阴性结果以“-”记录，将实验结果列表。 并以IMViC实验区分大肠杆菌、变形杆菌、产气杆菌、铜绿假单胞菌实验结果实验结果 反应结果大肠杆菌变性杆菌产气杆菌铜绿假单胞菌0-FFFFOKIAA/AGK/AGA/AGK/KI+-M

33、+-/+-VI-+-C-+/-H2S-+-U-+-I M Vi C结果大肠杆菌产气杆菌K I A 结 果空白对照 大 肠 杆 菌 变 形 杆 菌 铜绿假单胞菌O-F 实 验 结 果发 酵 型 氧 化 型V-P 实 验 结 果 阴 性 阳 性阴性 空白 阳性甲 基 红 实 验 结 果枸橼酸盐利用试验（唯一碳源）阳性 阴性阴性 阳性 空白尿 素 分 解 试 验阳性 阴性 吲 哚 试 验实验六 培养基制备、高压灭菌一、实验目的实验目的 掌握基础培养基的配制原理及其常规配制程序 掌握培养基及器皿的灭菌方法 了解高压蒸汽灭菌原理 学习并掌握高压蒸汽灭菌的操作及注意事项 二、实验原理 培养基培养基-是用人

34、工的方法将多种营养物质按照微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质，用以培养、分离、鉴定保存各种微生物或代谢产物。 分类：分类： 按营养物质来成分:天然培养基、半合成培养基、合成培养基 按培养基形态：液体、半固体（0.5%）、固体(12%) 按使用目的：选择培养基、加富培养基（血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液）、鉴别培养基等 常用培养细菌、放线菌和真菌的分别是：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基、马铃薯蔗糖培养基等固体培养基 琼脂在95的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45才重新凝固。 高压蒸汽灭菌法 一般用：0.1MPa（相当于15 lbf/in2或1.05 kgf/cm2），12

35、1.3 121.3 ，1530min可达到彻底灭菌的目的 含糖培养基用0.06Mpa（8 lbf/in2 或 0.59 kgf/cm2）112.6112.6灭菌 试管内的培养基以0.1Mpa，121.3 ，20min即可 高压灭菌技术关键是在压力上升之前将锅内冷气排尽冷气排尽。若锅内未排尽冷空气，结果会造成灭菌不彻底。 三、实验内容三、实验内容 每小组配400ml：液体培养基100ml、半国体50ml、斜面50ml、剩余作为250ml左右制成固体培养基，准备倾注1015个平皿 高压灭菌，无菌操作倾注平皿 四、实验材料四、实验材料 1、器械设备：药物天平及砝码，高压蒸汽灭菌器，隔水式培养箱，电炉

36、 2、玻璃器皿：（每组） 三角烧瓶（250ml）1只 无菌平皿（直径9cm）15只 试管 12100mm 40支（液体） 15100mm 20支（斜面10 半固体10） 烧杯（500ml）1只 刻度吸管10ml 2支 烧杯（100ml）2只 刻度吸管1ml 2支 量筒500ml1只 玻璃棒1支四、实验方法四、实验方法 牛肉膏蛋白胨培养基配方 组分含量（每1000ml） 牛肉浸膏5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂:半固体0.5%、固体培养基2% 自来水1000ml pH7.4-7.6 灭菌条件: 1.05kg/cm2 20min步 骤 计算和称量 -溶解-调节pH -过滤 -分装加塞 -包扎

37、-注明培养基名称、组名、日期-灭菌-搁置斜面或倾注平板-无菌观察 高压灭菌后培养基pH下降0.20.3 高压步骤 ：加水-放入待灭菌物品-加盖-加热、排放冷空气及升温灭菌-灭菌完毕降温及后处理 无菌试验 可抽取部分灭菌的培养基置37恒温培养箱中培养2448h。若无菌生长，即视为灭菌彻底。斜面的摆法和冷凝 倒平板 冷至556O时，在无菌室内以无菌操作倾入无菌的空平皿内，冷凝 9Omm 直径的平皿约需2Oml培养基。待凝固后翻转平皿 注意事项 1、药品的称量规则 2、调节pH值在加入琼脂之前 3、制备好的培养基应立即灭菌。 4、正确使用高压蒸汽灭菌器。 高压蒸汽灭菌法 灭菌时人不能离开现场，控制灭

38、菌的压力和温度，防治事故发生 根据不同的培养基可适当调整压力和温度，保护营养不被破坏。 灭菌结束，一定要待压力为零时才能打开锅盖。 高压灭菌技术关键是在压力上升之前将锅内冷气排尽冷气排尽。若锅内未排尽冷空气，结果会造成灭菌不彻底。 六、实验结果六、实验结果 每组完成： 40支液体、10斜面、10支半固体高层，倾注平板15-20只 将配制完成的培养基作好标记置冰箱保存 多余培养基在老师指导下回收在规定容器中。 实验七实验七 药敏实验（纸片法）和乳酸菌的染色药敏实验（纸片法）和乳酸菌的染色一、实验目的一、实验目的 掌握Kirby-Bauer法的实验操作技术 掌握K-B法的注意事项和质量控制二、实验

39、原理二、实验原理 干燥干燥的浸有一定浓度一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量一定量某种细菌的琼脂平板上。 药物药物在琼脂中的浓度随离开纸片的距离增大而降低。 当琼脂内的药物浓度恰高于该药对待检细菌的最低抑菌浓度，经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌环抑菌环。 测量抑菌环的大小抑菌环的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。 三、实验内容三、实验内容 标准菌株检测备检培养基、药敏纸片的质量 KB法检测临床分离菌株的药敏结果四、药敏试验步骤四、药敏试验步骤 菌种：平板上菌种：平板上1 1、2 2、3 3号菌号菌 1 1、5ml5ml细菌悬液的制备细菌悬液的制备-接种环沾取细菌接种环

40、沾取细菌( (约约3-43-4个菌个菌落落) )加入到加入到5ml5ml无菌生理盐水中，比浊达无菌生理盐水中，比浊达0.50.5麦氏单位麦氏单位 然后密集涂于平板培养基上，以便生长出均匀的菌苔然后密集涂于平板培养基上，以便生长出均匀的菌苔( (注注意不要划破培养基意不要划破培养基) ) 2 2、另一方面革兰氏染色，判断、另一方面革兰氏染色，判断G-G-或或G+G+ 3 3、做好标记、做好标记, ,酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片贴于平酒精点燃灭菌的小镊子取药物纸片贴于平板培养基上（注意距离），并轻轻按压贴紧板培养基上（注意距离），并轻轻按压贴紧 G- G- 菌菌: :氟哌酸（诺氟沙星）、丁胺卡那

41、（阿米卡星）、氟哌酸（诺氟沙星）、丁胺卡那（阿米卡星）、红霉素、复方磺胺（新诺明）、四环素、氯霉素、先锋红霉素、复方磺胺（新诺明）、四环素、氯霉素、先锋V V； G+ G+ 菌菌: :氨苄青霉素或青霉素氨苄青霉素或青霉素G G、红霉素、复方磺胺、四环、红霉素、复方磺胺、四环素（多粘菌素）、氯霉素、先锋素（多粘菌素）、氯霉素、先锋V V等。等。 每人使用每人使用1 1个个M-HM-H培养基做药敏实验培养基做药敏实验 3 3、放、放3737温箱培养过夜温箱培养过夜( (不超过不超过17h)17h)，调查结果。，调查结果。 五、实验结果五、实验结果 观察纸片周围有无抑菌环，并测其直径大小。 最终判断

42、细菌对每种抗菌药物的敏感程度，记录和报告结果 判定标准：实验条件不同判定标准可有所不同。参照抑菌环直径与结果解释的标准（见附表10-2和10-3）。纸片分布抗生素对细菌的作用实验八实验八 ss培养基配制、真菌、放线菌培养，一、实验目的 学习真菌的接种方法和放线菌的分离 学习观察酵母菌、曲霉、根霉、青霉、细黄链霉菌的菌落形态特征。 掌握酵母菌、放线菌、霉菌主要的培养特性 二、实验原理二、实验原理 放线菌和霉菌的细胞都是丝状，固体培养基:营养菌丝营养菌丝(或基内菌丝)、气生菌丝、孢子丝气生菌丝、孢子丝 气生菌丝向空间生长，菌丝之间无毛细管水，因此菌落外观呈干燥、不透明的丝状、绒毛状或皮革状等特征。

43、由于营养菌丝伸入培养基中使菌落和培养基连接紧密，故菌丝不易被挑起不易被挑起 由于气生菌丝、孢子和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面正反面呈不同的颜色。 丝状菌是以菌丝顶端延长菌丝顶端延长的方式进行生长的，越近菌落中心的气生菌丝其生理年龄越大，也越早分化出子实器官或分生孢子，从而反映在菌落颜色上的变化，一般情况下，菌落中心的颜色常比边缘深。有些菌的营养菌丝还会分泌水溶性色素并扩散到培养基中而使培养基变色。有些菌的气生菌丝在生长后期还会分泌液滴，因此，在菌落上出现“水珠”。 霉菌属真核生物，它们的菌丝一般较放线菌粗(几倍)且长(几倍至几十倍)，其生长速度比放线菌快，故菌落大而疏松或大而紧密。由于气生

44、菌丝会形成一定形状、构造和色泽的子实器官，所以菌落表面往往有肉眼可见的构造和颜色。因此，用低倍显微镜即可观察。 孟加拉红孟加拉红（虎红）培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。这种培养基的特点是培养基中加入的孟加拉红，能有效地抑制细菌和放线菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 马铃薯蔗糖培养基马铃薯蔗糖培养基是一种广泛用于霉菌的培养基，在配制过程中，不经pH调节而呈自然状态。PDA培养基是一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数。 高氏一号高氏一号培养基是一种用于放线菌的合成培养基，以

45、可溶性淀粉作为碳源和能源，硝酸钾作为氮源，磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁作为无机盐。放线菌的培养往往在平板中加入0.5%重铬酸钾溶液（或50U/ml制霉菌素) 以抑制霉菌的生长。 沙保弱沙保弱培养基是一种培养鉴定酵母样真菌的传统培养培养基，最常用于临床上念珠菌的分离培养。 SS培养基 SS培养基是一种分离培养粪便标本中沙门菌和痢疾杆菌的强选择性培养基之一。 培养基组成 营养物：牛肉膏、蛋白胨； 抑制剂：煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等-抑制非病原菌的生长。 鉴别用糖：乳糖 指示剂：中性红淀粉琼脂培养基配方淀粉琼脂培养基配方( (高氏一号高氏一号) ) 马铃薯蔗糖琼脂培养基成分（马铃薯蔗糖琼脂培

46、养基成分（PDAPDA） 三、实验内容三、实验内容 SS培养基配制-250ml/组。 练习平板稀释划线法分离单菌落 白色假丝酵母菌、曲霉、根霉的小室培养 观察酵母菌、白假丝酵母菌、细黄链霉菌曲霉、根霉、青霉在不同培养基上的形态特征。 实验步骤1 1、SSSS培养基的配置方法培养基的配置方法-配置配置250ml/250ml/组组（参照说明）（参照说明） 计算和称量 -溶解-调节pH -过滤 -分装加塞 -包扎 -注明培养基名称、组名、日期-倾注平板-无菌观察 不需高压灭菌高压！2 2、练习平板稀释分区划线法获得单菌落、练习平板稀释分区划线法获得单菌落 2块/人四、实验方法四、实验方法制备菌悬液或

47、孢子悬液：孢子悬液：在培养好的斜面菌种管内加入5mL无菌水，振荡混匀,制成菌悬液后备用（已制备）。1、分离放线菌： A土壤津液10-2 取0.5ml于4.5ml的生理盐水中混匀（ 10-3 ）再取10-3 0.5ml于4.5ml的生理盐水中混匀获得10-4 分别取1ml 10-3 、 10-4加入到20ml的高十一号培养（60Co）+10%苯酚抑制细菌和真菌的生长混合倒平板，凝固后28Co培养霉菌培养箱1周四、实验方法四、实验方法2、酵母菌-分区稀释划线法接-菌种为试管斜面 所用培养基为沙宝弱培养基，1块平板/人3、霉菌（丝状真菌）接种：B、C、D（分别为根霉、曲霉和青霉） 用三点接种法三点接

48、种法获得霉菌的菌落。 使用 沙宝弱、虎红培养基分别接三种真菌各1块/组（每组3块虎红、3块沙宝弱） 分离与接种的酵母菌、真菌于2828培养2-3d，霉菌置2828培养5-7d，待长成菌落后，仔细观察，并记录观察结果。小室培养 准备湿室准备湿室 在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“冂”形载玻片搁架，在搁梁上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经12l湿热灭菌30min后，置60烘箱中烘干，备用。接种接种 用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。加培养基加培养基 用无

49、菌细口滴管吸取少量融化约60的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以l/2小滴为宜)。加盖玻片加盖玻片 在培养基未彻底凝固前用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气。倒保湿剂倒保湿剂 每皿倒大约3mL 20%的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度，皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置2828恒温培养恒温培养3-5d3-5d。 五、实验结果五、实验结果 真菌的菌落从形态观察可分三大类：酵母菌落、酵母样（型）菌落及丝状菌落。1、酵母菌落（观察酿酒酵母菌培养

50、物）：菌落为圆形、较白色，边缘整齐表面光滑、湿润，假菌丝不伸入到培养基内，和表皮葡萄球菌菌落相似。 2、酵母样（型）菌落（观察白假丝酵母菌）：表面和酵母菌落相似，但生成的假菌丝伸入培养基内。 3、丝状菌落：观察各种丝状菌（Dermatophytes）斜面培养物,菌落表面大都有气生菌丝（Aerial mycelium）,肉眼观察呈绒毛状、粉状、棉花样等，故称丝状菌落，色泽多种多样，红色毛菌呈紫红色，铁锈色毛菌呈铁锈色或棕色等，菌落底层有营养菌丝（Vegetative mycelium）伸入培养基内。注意放线菌与霉菌的区别。4、白假丝酵母菌 接种到玉米-吐温琼脂小室培养4872观察厚膜孢子。白假丝

51、酵母菌接种到血清管68h观察芽管形成情况，继续培养1824h，观察假菌丝。5、湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养1620h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和黑霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉的假根，青霉可形成顶囊的分生孢子梗和帚状枝等。菌落形态 湿润（群体形态） 干燥小而薄，较大而薄-细菌又大又厚，颜色单一-酵母菌小而致密-放线菌大而疏松-霉菌个体形态分散的细胞细丝体小而分散-细菌大而分散-酵母菌纤细-放线菌粗壮-霉菌放线菌与霉菌菌落特征放线菌与霉菌

52、菌落特征 放线菌和霉菌的细胞都是丝状，固体培养基:营养菌丝营养菌丝(或基内菌丝)、气生菌丝、孢子丝气生菌丝、孢子丝 气生菌丝向空间生长，菌丝之间无毛细管水，因此菌落外观呈干燥、不透明的丝状、绒毛状或皮革状等特征。由于营养菌丝伸入培养基中使菌落和培养基连接紧密，故菌丝不易被挑起不易被挑起 由于气生菌丝、孢子和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面正反面呈不同的颜色。酵母菌的菌落酵母菌的菌落酵母菌的细胞结构酵母菌的细胞结构酵母菌细胞形态子囊孢子有性繁殖酵母菌的细胞 结构与其他真核生物基本相同，右图是电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示意图。液泡1)单层膜包裹的细胞 器；含有机酸、盐 类 水溶液和水解 酶类。

53、 2)调节渗透压； 与细胞质进行物质 交换； 储藏物质。 3)为细胞成熟的标志 菌落特征：菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。灰等多种颜色。霉菌的培养特征霉菌的培养特征各种曲霉的菌落 东京根霉 酵 母菌 落 形 态黑曲霉毛霉菌霉菌孢子污染平板高盐察氏斜面 孟加拉红斜面三点接种（正

54、面）三点接种（背面）曲霉菌生长（正面）曲霉菌生长（背面）镜下观察真菌结构根霉（根霉（Rhizopus)Rhizopus)分类地位：与毛霉同属接合菌纲毛分类地位：与毛霉同属接合菌纲毛霉目霉目形态特征：菌丝为白色、形态特征：菌丝为白色、无隔无隔多核多核的单细胞真菌，多呈的单细胞真菌，多呈絮状絮状。繁殖方式：无性产繁殖方式：无性产孢囊孢子孢囊孢子，有性，有性产产接合孢子接合孢子代表种：米根霉（代表种：米根霉（R.oryzae)R.oryzae) 应用应用: :产酶、产酶、产酸、甾体产酸、甾体转化转化Rhizopus 与毛霉区别：根霉有假与毛霉区别：根霉有假根和匍匐枝，与假根相根和匍匐枝，与假根相对处

55、向上生出孢囊梗。对处向上生出孢囊梗。孢子囊梗与囊轴相连处孢子囊梗与囊轴相连处有囊托，无囊领。有囊托，无囊领。曲霉曲霉(Aspergillus)分类地位：多数属于子囊菌亚门，少数属于分类地位：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门半知菌亚门形态特征：菌丝发达多分枝，有隔多核，分形态特征：菌丝发达多分枝，有隔多核，分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞胞足细胞足细胞上垂直生出；分生孢子头状如上垂直生出；分生孢子头状如“菊花菊花”繁殖方式繁殖方式 ：分生孢子分生孢子，有性，有性- - 子囊孢子子囊孢子代表种：黑曲霉代表种：黑曲霉(Asp . Niger(Asp

56、. Niger）、黄曲霉）、黄曲霉(Asp.flavus)(Asp.flavus)应用：制酱、酿酒、制醋，应用：制酱、酿酒、制醋，生产酶，生产有机酸，生产生产酶，生产有机酸，生产糖化饲料糖化饲料危害：黄曲霉毒素危害：黄曲霉毒素（aflatoxin)aflatoxin)是一种肝毒素是一种肝毒素Aspergillus黑曲霉的分生孢子头黑曲霉的分生孢子头（四）青霉（四）青霉（Penicillum):分类地位：多数属于子囊菌亚门，少数属于分类地位：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门半知菌亚门形态特征：与曲霉类似。但无足细胞，分生形态特征：与曲霉类似。但无足细胞，分生孢子梗从基丝或气丝上生出，有横隔

57、，顶端孢子梗从基丝或气丝上生出，有横隔，顶端生有扫帚状的分生孢子头生有扫帚状的分生孢子头繁殖方式：分生孢子、有性繁殖方式：分生孢子、有性- -子囊孢子子囊孢子代表种代表种 ：产黄青霉、桔青霉、展青霉：产黄青霉、桔青霉、展青霉应用：生产抗生应用：生产抗生素、生产有机酸素、生产有机酸危害：霉变、疾危害：霉变、疾病病根霉假根黑曲霉足细胞和菌丝 根霉匍匐枝 曲霉孢子囊及孢子根霉孢子囊曲霉菌丝及孢子囊酵母细胞和芽殖厚 膜 孢 子厚 膜 孢 子放线菌的菌落形态放线菌的菌落形态质地质地: 致密、干燥、多皱、小致密、干燥、多皱、小而不蔓延、不挑起，表面有而不蔓延、不挑起，表面有放射状沟纹。放射状沟纹。 形状：

58、随菌种不同可有两类：形状：随菌种不同可有两类： (1)产生大量分枝状菌丝的菌产生大量分枝状菌丝的菌种：种： 如如Strptomyces)形成与培形成与培养基结合较紧的养基结合较紧的 菌落，不易菌落，不易挑起或整个挑起。挑起或整个挑起。 (2)不产生大量菌丝的菌种：不产生大量菌丝的菌种： 如如Nocardia形成的菌落呈粉形成的菌落呈粉质，挑之易碎质，挑之易碎放线菌孢子丝类型：二级轮生一级轮生丛生松螺旋紧螺旋钩状单轮生单轮生螺旋状螺旋状放线菌孢子丝的显微图片放线菌孢子丝的显微图片: :Coiled aerial hyphae横隔分裂缩缢分裂分生孢子孢子囊孢子无性孢子（主要）无性孢子（主要）菌丝片

59、段菌丝片段放线菌的繁殖放线菌的繁殖放线菌的繁殖方式放线菌的繁殖方式孢子形态及其特点孢子形态及其特点实验九实验九 肠道致病菌的分离（一）ss培养基配制 SS琼脂作为粪便标本分离培养沙门菌与痢疾杆菌用的强选择强选择性培养基之一，成分较多，大体可分为营养物质、抑制物质及促进目的菌生长物质及鉴别用指示剂。 培养基组成 营养物：牛肉膏、蛋白胨 抑制剂：煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制非病原菌的生长。 促进目的菌生长的物质：胆盐既为抑制剂又能促进病原菌，特别是沙门菌的生长。 鉴别用糖：乳糖。 指示剂：中性红 配置:计算-称量-加水-煮沸-倒平板SS培养基组成成分 分离培养与形态观察 直接分离分离培

60、养。将模拟标本（大肠埃希菌和沙门菌的混合菌液）分区划线法接种于s.s琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，置37温箱内培养1824h，观察培养基上两种菌落的特征。 选择性增菌选择性增菌培养。无菌吸管吸取混合菌液或经处理的病料上清液按1：10的比例加入亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）中，置37培养68h。按步骤（1）进行分离培养。 形态观察。分别挑取上述平板中单独菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检，观察两种细菌的形态、大小与排列方式，进行比较。大肠埃希菌在伊红美蓝平板上产生带金属光泽的菌落，在S.S平板上形成红色的菌落红色的菌落；沙门菌大多数菌株因沙门菌大多数菌株因不发酵乳糖不发酵乳糖伊红美蓝平板上形成无色菌