课程设计范例

1、 山东农业大学 生物技术课程设计题目： 不同启动子对RNA介导的病毒抗性的影响 姓名： 学号： 年级： 专业： 指导教师： 山东农业大学生命科学学院二 年 月 日一、选题依据（拟开展研究项目的研究目的、意义）双链RNA 导致基因沉默RNA 干涉,它是一种普遍存在于生物界的生命现象, 也是现在生命科学领域的一个研究热点。尽管对RNAi 的机制研究已经取得许多重要的成果, 但是仍有许多环节需要进一步地探查。RNA 干涉(RNAi)是利用双链RNA 特异性的降解相应序列的mRNA , 从而特异性的阻断相应基因的表达。RNA介导的病毒抗性技术是利用病毒本身的一些基因导入植物从而获得抗病毒植株，也称为源

2、于病原诱导的抗病，是植物病毒基因工程常用的策略。马铃薯Y病毒(PVY)对马铃薯、烟草等重要经济作物危害十分严重，其侵染所造成的损失可达80%，尤其是马铃薯Y病毒坏死株系（PVYN）可以造成寄主提前死亡而绝收。本研究以马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3端400bp 的序列为靶目标设计反向重复序列,插入含有三种不同类型启动子的表达载体PCAMBIA1300中，构建hpRNA结构的植物表达载体，转化烟草，进行抗病性鉴定，分析不同启动子对RNA介导的病毒抗性的影响，寻找能够引发RNA介导病毒抗性产生的最佳类型的启动子，同时探讨启动子对RNA介导病毒抗性的作用本质。二、文献综述内容（在充分收集研究主题相关资料的

3、基础上，分析国内外研究现状，提出问题，找到研究主题的切入点，附主要参考文献）RNA干扰（RNA interference, RNAi）现象最早是在植物中发现的。1990年，Napoli等将查尔酮合成酶(CHS)基因导入到紫花矮牵牛中，旨在加深花的颜色，但结果花的颜色不但没有加深，而变成白色或紫白相间。分析发现转基因植株并没有新的基因表达，反而使植物本身的色素合成基因也受到了抑制。当时将这种现象称为共抑制（Co-suppression）或转录后的基因沉默（PTGS）。随后， Dougherty等（1992年）用烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）的非翻译CP基因转化烟草，

4、发现在表现抗性的植物细胞核中，转入病毒CP基因的转录正常，甚至加强，但在细胞质中的积累大大降低。这与在研究chs基因的结果极为相似，也是一种转录后基因沉默（PTGS）。这种抗性被称为RNA介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance, RMVR）。继在植物中发现PTGS后，目前已在微生物、动物中也发现与PTGS类似的现象，如在真菌内发现的“quelling”(Guo, 1995)、线虫、果蝇内发现的RNAi（Fire,1998 ；Zamore,2000）。根据上述各种基因沉默的特点和性质，可统称为RNA干扰或RNA沉默。RNA沉默是生物体内由双链RNA（doubl

5、e-strand RNA，dsRNA）引发的同源mRNA降解现象(Hammond, 2001; Phillip, 2002; Kawasaki, 2003)。在细胞中，dsRNA在Dicer酶的作用下从两端逐段酶解大小约2125nt的小分子双链RNA (Small interfering RNAs，siRNAs)片段。双链siRNAs形成后，与RNA诱导的RNA沉默复合体（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）结合，在ATP酶的作用下将双链siRNA解开成单链RNA。在ss-siRNA的引导下，识别与其同源的靶mRNA，一旦siRNA和靶mRNA互补配对，RIS

6、C中的核酸酶就将靶RNA从siRNA中点的对应位置处切断，导致靶RNA降解。RNA沉默的显著特征是这种沉默作用可以被扩大。这种扩大作用可能是由于反义siRNA与靶mRNA结合，在RdRP的作用下扩增出dsRNA。然后在Dicer的作用下可形成大量的siRNA。建立dsRNA的高效植物表达载体，对于成功地应用RNAi技术培育抗病毒的转基因植物起着至关重要的作用。对于转基因来说，dsRNA形成的途径的最佳途径是通过构建的发夹结构（hairpin）的外源基因转录产生。具有发夹结构的外源基因由两段反向重复（IR） DNA序列和一段其他DNA（spacer）序列组成，两段IR DNA由spacer连接起

7、来。这样的结构所转录的RNA会形成发夹结构（hairpin RNA, 简称hpRNA）。hpRNA由具有双链结构的“茎”（stem， 是IR DNA转录的产物配对形成双链）和单链结构的“环”（loop，是spacer DNA转录的产物）组成。研究发现，在一般的转基因植物中（即含有非hpRNA结构外源基因的转基因植物），产生基因沉默的几率一般为10%30%；而转录后能形成双链RNA的转基因（hpRNA结构的转基因）诱发基因沉默的几率较高，可达到6080%以上；尤其对于转录后形成的“环”（loop）为内含子的发夹结构（ihpRNA），诱发基因沉默的效率更高，有的可达100%（朱俊华, 2004;

8、竺晓平, 2006; Smith, 2000; Wesley, 2001; Zamore, 2002; Helliwell, 2003; Pandolfini, 2003） 。基于hpRNA表达而诱导的基因沉默已在多种生物、多种基因上获得成功（Smith, 2000; Wesley, 2001; Piccin, 2001; Paddison, 2002; Stoutjesdijk, 2002; Helliwell, 2003）。通过对hpRNA的研究表明，hpRNA中的双链“茎”（stem）部分是诱发基因沉默的关键部位。茎的长短可影响RNA沉默的效率及稳定性。在植物转基因研究中，Helliwe

9、ll（2003）等研究发现，501000bp的基因片段均能诱发基因沉默，但基因片段越短，基因沉默的效率越低；并认为片段长度为300600bp时，是合适的，且可以获得最高的基因沉默效率。在RNA介导的病毒抗性研究中，我们的研究结果表明stem的长度为200bp、100bp和50bp的茎长度均可高效的诱导病毒抗性，但200bp的效率更高（竺晓平，2006；迟胜起，2005；李鹏，2007）。茎长度选择的原则是，在保证足够效率的基础上，选择尽可能短的片段。这样，第一，可减少外源DNA的插入对植物细胞染色体DNA造成的不良影响；第二，可进一步提高转基因植物的生物安全性；第三，可很方便地将同一病毒不同功

10、能基因的cDNA区段或不同病毒的cDNA连接在同一载体上，从而更高、更持久抗性或多病毒抗性的植物。从目前已有的研究结果看，较短的适宜茎长度为300bp左右。hpRNA中的“环”（loop）也可对PTGS （RNA沉默）产生影响，loop的长度直接影响hpRNA的形成和稳定性。在一定范围内，短loop有利于hpRNA的形成和稳定，但loop过短会影响IR结构DNA的在细菌内的克隆。Piccin等（2001）在研究hpRNA引发果蝇Y基因（长度为1120bp）沉默中的研究中使用GFP基因片段为spacer，结果表明当loop长度为330nt时，对dsRNA引发的RNAi无显著影响，且极大地提高了I

11、R克隆的效率；而当loop长度为150nt时，则对提高IR克隆的效率没有帮助。Wesley（2001）等报道，在植物中，当loop长度为3050nt，stem的长度为98bp时，就可引发100%的基因沉默。我们的研究表明，当stem为200nt长度时，50nt长度的loop可有效地形成稳定的hpRNA（朱俊华等，2004）；当stem长度为300nt时，载体的构建相当困难。从目前的研究结果看，较适宜的茎环比例应为3/14/1（温孚江，2004国家基金）。适宜茎长度和茎环比例的确定为研究中构建dsRNA的高效表达载体提供了依据。高效启动子的选用可能也是高效诱发RNAi的另一重要因素。Que等（1

12、997）研究发现由强启动子驱动的chs转基因引起的PTGS比用弱启动子驱动转基因要有效的多。Waterhouse 等（1998）用35S启动子驱动残缺的部分基因被排列成发夹RNA（hairpin RNA）转录物的反向重复uidA转基因，结果获得很高的沉默发生率（90%），而用不带启动子的反向重复结构基因沉默则明显地减少，推测高强度的转录可能较低强度的转录更易于产生dsRNA，说明转录产物产生的速率对于激发PTGS是非常重要的。玉米乙醇脱氢酶基因启动子（ubi ）具有高效启动转录的作用,并且它基本不受组织细胞的限制，是禾本科植物中较为常见的启动子，能够有效地提高外源基因在水稻愈伤中的瞬间表达，效

13、率为35S启动子的4倍。Pnzip 启动子是一种具有严格组织专一性的启动子, 它能驱动外源基因在光合组织中特异、高效表达，效率为35S启动子的9倍。在RNA介导的植物病毒抗性研究中，目前尚未见有关比较不同类型启动子抗病性的系统报道，本研究将在这方面进行深入、系统地探讨。主要参考文献：1 Boogaart TV, et al. Replicase-derived resistance against Pea early browning virus in Nicotiana benthaminaa is an unstable resistance based upon posttranscri

14、ptional gene silencing. MPMI,2001,14(2):196-203.2 Boutla A, et al. Short 5-phosphorylated double-stranded RNAs induce RNAinterference in Drosophila. Cuurr Biol, 2001, 11: 1776-1780.3 Cogoni C & Macino G.Posttranscriptional gene silencing in Neurospora by a RecQ DNA helicase . Science, 1999,286:2342-

15、2344.4 Cogoni C, et al. Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek, 1994, 65 (3): 205 - 209.5 Derek M, et al. Silencing viral infection. PLoS Medicine, 2006, 3 (7):1000-1004.6 Dougherty W G, et al. Transgenes and gene suppression: Telling us something new?. Curr

16、 Opin Cell Biol, 1995, 7:399-405.7 Einav Y, et al. shRNA-mediated RNA interference as a tool for genetic synthetic lethality screening in mouse embryo fibroblasts. FEBS Lett. 2005, 579(1):199-202.8 Elbashir S M, et al. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAsJ. Genes Dev ,2001, 15:

17、188-200.9 Fire A, et al.Potent and spacific genetic interferenoe by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature, 1998, 391:806-811.10 Gil, J. & Esteban, M. (2000) Apoptosis 5, 107114.11 Grishok A, et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small te

18、mporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell, 2001,106:2334.12 Herrera Estrella L,et al.Light-induced and chloroplast-associated experession of chimearic gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vectorJ.Nature,1984,310:115120.13 Vasil V,et al.Herbicide resistant fe

19、rtile transgenic wheat plants obtained by particle bombardment of regenerable callusJ.Bio/Tech,1992,10:667674.14 Wilson T M A.Strategies to protect crop plants against virus:pathogen-derived resistance blossomsJ.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:3134!3141.15 Fujimoto H,et al.Insect resistant rice gener

20、ated by the introduction of a modifide-endotoxin gene of Bacillus thuringiensisJ. Bio/Tech,1993,11:11511155.16 Oeller P W, et al. Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNAJ.Sciece,1991,254:437439.17 Mariani C, et al. Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonu

21、clease geneJ.Nature,1990,347:737741.18 Gasser C S, Fraley R T. Genetically engineering plants for crop impovementJ.Science,1989,244:1293!1299.19 Van der Salm T, et al. Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis cryIA(b) and cryIC genes:a resistande management

22、 strategyJ. Plant Mol Biol,1994,26:5159.20 白庆荣, 等. 利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草。植物病理学报，2005，35（2）：148-154.21 迟胜起. 核基质结合区对马铃薯Y病毒非翻译CP基因及反向重复片段介导的抗病性影响. 植物病理学报， 2005，35（4）：345-35122 樊龙江, 等. 转基因植物的基因漂流风险. 应用生态学报,2001 (4):151-153.23 郭兴启, 等. 利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草. 植物病理学报, 2001b, 31（4）: 349-356.24 郭兴启,

23、 等翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较，病毒学报， 2001a，17(4)：360-367. 25 赖延东，等。应用定量竞争RT-PCR筛选芳香烃受体基因RNA干扰片段。卫生研究， 2006，35（1）：7-9。26 李 鹏, 等. 马铃薯Y病毒CP基因5端和3端反向重复结构介导的抗病性研究。植物病理学报, 2007, 37(1):69-76.27 李建龙，等。SiRNA活性与mRNA二级结构关系的研究。生物医学工程研究，2006，25（1）：4652.28 刘晓玲, 等. PVX 25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究。作物学报，2005，31（7）：827-8

24、32。29 温孚江, 等. 转录后基因沉没与植物的病毒抗性. 生物工程学报, 2001, 17(3)：213-235.30 羊正纲，等。 载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立。中华肝脏病杂志，2004，12（9）：51551831 赵明敏, 等. 瞬时表达靶向TMV外壳蛋白基因的siRNA能干扰病毒侵染. 植物病理学报, 2006, 36(1):35-40.32 赵远. RNA干扰治疗马凡综合症的载体和靶位点基础. 博士论文, 2003年.33 朱常香, 等. RNA介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传. 遗传学报, 2005,32 (1): 94-103.34 朱俊华, 等.

25、 马铃薯Y病毒衣壳蛋白基因片段长度对RNA介导抗病性的影响. 中国科学（C辑）, 2004b 34（1）: 23-30.35 朱俊华, 等. 正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究. 植物病理学报, 2004a, 34（2）:133-140.36 竺晓平, 等. 马铃薯 Y病毒CP基因的短片段及其反向重复转基因烟草的RNA介导的抗病性研究. 中国农业科学, 2006, 39（6）:1153-1158.杨予涛 ，等.一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析.中国科学（C辑）.2003, 8, 33（4）：228-306.三、研究方案（主要研究内容、研究方法和技术路线）本研究

26、以马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3端400bp 的序列为靶目标设计反向重复序列,插入含有三种不同启动子的表达载体PCAMBIA1300中，构建hpRNA结构的植物表达载体，转化烟草，进行抗病性鉴定，分析不同启动子对RNA介导的病毒抗性的影响，寻找能够引发RNA介导病毒抗性产生的最佳类型的启动子，同时探讨启动子对RNA介导病毒抗性的作用本质。研究方法1不含内含子的反向重复序列的表达载体的构建 hpRNA的构建如图所示 转录 400bp 100bp 2含有内含子的反向重复序列的表达载体的构建hpRNA的构建如图所示载体的构建以双元载体pCAMBIA1300为基础。设计引物（两端加上适宜的限制性内切酶位点），PCR分别扩增花椰菜花叶病毒35S（CaMV35S）启动子、水稻肌动蛋白基因Act1启动子、玉米乙醇脱氢酶基因Ubi启动子和PNZIP基因启动子和胭脂碱合成酶基因3端Nos终止子。将扩增的启动子和终止子连接于双元载体pCAMBIA1300中，获得含有不同启动子的重组的表达载体。以已克隆的PVY的CP基因3段400bp的cDNA区段为目的基因，分别反向重复插入含有不同启动子植物表达载体pCAMBIA1300中。在SacI位点和EcoRI位点之间插入Nos 3终止子，在XhoI单位点插入NptIII抗性基因，在HindIII和BamHI位点