基因工程的基本技术

1、基因工程的基本技术 第1页/共59页主要内容主要内容 核酸提取技术核酸提取技术 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 PCR PCR技术技术 DNADNA重组技术重组技术 核酸杂交技术核酸杂交技术 基因文库构建基因文库构建基因工程技术 重组子克重组子克隆隆第2页/共59页基因工程的基本技术基因工程的基本技术之一之一第一节第一节第3页/共59页一、核酸提取技术一、核酸提取技术 核酸包括脱氧核糖核酸（ DNA ）和核糖核酸（RNA）; 脱氧核糖核酸（ DNA ）包括线状基因组DNA和环状DNA（质粒DNA）。第4页/共59页1、植物组织中基因组DNA的提取思考：思考：DNA如何从细胞中取出？如何从细胞中取出？

2、第5页/共59页植物组织中基因组DNA的提取原理： 用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。第6页/共59页再思考：1、研磨破碎组织必 须在低温下进行。-为什么？2、幼嫩组织DNA 的得率高还是低？防止防止DNA降解降解。得率高！第7页/共59页 提取DNA的质量鉴定： DNA的相对完整性：凝胶电泳 DNA的纯度：测OD值吸收峰： DNA 紫外光260nm 蛋白质 紫外光280nm比值： OD260/2

3、80 = 1.8-2.0 较纯 OD260/280 解螺旋2、电场：直流电场 电压高则快 电压太高则结果不准确 常用35V/CM第19页/共59页操作简单；分辨范围：100bp-60kb； 有效范围：200bp-50kb； 分辨率：100bp左右3、支持物介质低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65）A 种类：琼脂糖（agarose）凝胶：第20页/共59页常用于微卫星、测序分析；分辨范围：5-500bp； 分辨率：1bp聚丙烯酰胺凝胶：注意：有神经毒性！第21页/共59页 凝胶分辨DNA的能力： 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 浓度 分辨范围(kb) 浓度 分辨范围(bp) 0.3% 5-60 3.5

4、1000-2000 0.6% 1-20 5 90-500 0.7% 0.8-10 8.0 60-400 0.9% 0.5-7 12 40-200 1.2% 0.4-6 15 25-160 1.5% 0.2-3 20 6-100B 凝胶浓度凝胶浓度: 浓度浓度大大，筛孔小，适合，筛孔小，适合小小分子电泳；分子电泳； 浓度浓度小小，筛孔大，适合，筛孔大，适合大大分子电泳分子电泳凝胶浓度的选择：取决于待检测的凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小的大小原来如此！第22页/共59页4 、电泳缓冲液 pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大 发热快胶溶解 种类：TAE （Tris+ED

5、TA+醋酸）:电流大，易产生离子富集TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）第23页/共59页电泳缓冲液的选择TBE缓冲力大于TAE；高分子量的DNA选用TAE，否则选用TBE；基因组DNA酶切电泳选用TAE； 实验技巧：问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于离子的富集离子的富集作用作用，DNA在凝胶中出现跑不动现象。解决办法：一是更换成新配置的电泳缓冲液；二是把电泳槽中倒出混匀后重新使用。WHY?大家注意了！第24页/共59页（二）、电泳指示剂和DNA染色剂、类型：溴酚兰，二甲苯青、作用：(1)

6、 预知电泳的速率及方向；(2) 使样品呈现颜色，便于加样；(3) 与一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度。 电泳指示剂第25页/共59页 DNA染色剂 荧光染色剂,溴化已锭：（ EB, Ethidium bromid）吸收300360nm UV（紫外光）放出590nm可见光（橙红色） 硝酸银：常用0.1% Goldview染料染料吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红色光（单链DNA）第26页/共59页（三）凝胶电泳过程1、制胶：称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒入制胶槽配制；2、放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶23mm,3、点样：把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样4、电泳

7、：接通电源，调好电压5、看结果：紫外光观察。第27页/共59页1、单向电泳、单向电泳2、脉冲电场电泳（、脉冲电场电泳（CHEF）3、反转反转电场电泳（电场电泳（FIGE）（四）、电泳种类（四）、电泳种类第28页/共59页 中文名称：聚合酶链式反应 1、PCR原理： 变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。技术3： PCR技术(polymerase chain reaction)

8、第29页/共59页PCRPCR操作流程操作流程949450 50 72 72 第30页/共59页 2、 PCR反应过程：变性：变性：DNADNA双链变为单链；双链变为单链；退火：引物与模板结合；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；延伸：合成互补链；上述过程通过上述过程通过PCRPCR仪的仪的程序设计及自动运作完程序设计及自动运作完成。成。第31页/共59页 3、 PCR反应体系：体系成分：模板模板DNADNA、引物、引物、TaqTaq酶酶( (热稳定热稳定性性) )、 dNTPdNTP、反应缓冲液、反应缓冲液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、DTT 、 Tris.cl ） 。第32页

9、/共59页1）、引物（寡聚核苷酸）一般成对出现，长度为15-30个核苷酸； 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM； 引物设计原则： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体第33页/共59页2）、模板DNA： 基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； 质量要求：不高3）、Taq酶(热稳定性)： 常规酶 高保真酶：ExTaq La Taq酶4）、反应缓冲液成分： BSA、Tween20、DTT、明胶-保护酶作用 Tris.cl提供缓冲作用第34页/共59页(2)、 dNTP的浓度： 常用100-200mol/L，不能

10、低于20mol/L，特异性、保真性； 4、影响影响PCR 产量、质量的因素：产量、质量的因素：(1)、 Taq酶：常用酶：常用1U/25L 浓度低，扩增产物不够；浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加；浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性；酶的活性；第35页/共59页(3)、模板：主要考虑模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.(4)、引物浓度：引物浓度： 0.1-0.5mol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体引物二聚体；(5)、 Mg2+浓度：浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物

11、-模板退火、特异性第36页/共59页 (6)、 PCR反应程序设定：反应程序设定：(1)、变性温度和时间、变性温度和时间： 要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5 （2小时）95 （40min）97 （5min）94变性比较彻底，酶的半衰期也不短。(2)、引物退火温度、引物退火温度Tm与时间；与时间； Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2， G、C计为4，时间一般为40秒到60秒(3)、 引物延伸温度与时间引物延伸温度与时间： 72最佳，30-100nt/s，也有用68 如La Taq(4)、循环数：、循环数： 25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增加；平台效应；第37页/

12、共59页以普通以普通PCR 50 l reaction solution 为例为例)10 PCR buffer25mM MgCl2dNTP Mixture (10mM each)primer 1 （10 M)primer 2 (10 M)Taq polymerase (5U/ l)DNA template (0.1 g/ l)ddH2O total5 l (1 )4 l (2mM)1 l(0.1mM)1 l(0.2 M)1 l(0.2 M)0.6 l(2U/50 l)1 l36.5 l50 l5、PCR例子（例子（Example of reaction solution）反应体系配置：反应体系

13、配置：第38页/共59页 PCR thermal program94 C94 CTm72 C72 C4 C1min30sec30sec1min5 Cendless30 cycles 循环数循环数Heat denaturationHeat denaturePrimers annealingExtensionLast extensionEnding reactionTa: annealing temperature设计的反应程序设计的反应程序相应作用相应作用第39页/共59页6、PCR的种类RT-PCR特异特异PCR锚定锚定PCR反向反向PCR套式套式PCR不对称不对称PCR长程长程PCR锅柄锅柄

14、PCR免疫免疫PCRRAPD定量定量PCR原位原位PCR第40页/共59页 F R （1）特异特异PCR 扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。定的。 （2）RT-PCR： 是一类以是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。为最初模板的基因的扩增。A A A A A A A A A A5CAPT T T T T T T T T T T第41页/共59页 （3）反向反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列酶切酶切酶切酶切引物引物2引物引物1此PCR操作过程：酶切基因组DNA连接环化目的DNA用引物

15、1和引物2组合扩增出侧翼序列第42页/共59页 （4）定量PCR用途：用途：分析基因组中某个基因的拷贝数或分析基因的转录表达丰度。第43页/共59页 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。概念：概念：第44页/共59页 原理：通过原理：通过实时检测实时检测PCRPCR每一个循环扩增产物相对每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，应的荧光信号，来实现对来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量初始模板量X0的对数值与的对数值与C(T) 值之间呈线性关系：值之间呈线性关系：log X0=

16、- log(1+Ex) *Ct+ log N 第45页/共59页Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04阈值线阈值线CtCt值值CtCt值值Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示）第46页/共59页 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcyc

17、le 6-15 荧光域值（threshold）的设定第47页/共59页 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值与起始模板的关系Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04阈值线阈值线CtCt值值CtCt值值第48页/共59页荧光信号如何产生？荧光信号如何产生？荧光化学试剂荧光化学试剂第49页/共59页思考题1 假设通

18、过基因枪轰击技术，获得一株具有抗旱目的性状的转基因水稻，但此转基因水稻出现了株高比非转基因对照水稻变矮的非靶性状。 用PCR相关技术回答下列问题： 1、如何确认此苗是转基因苗？ 2、目的基因是否表达？表达量如何？ 3、株高变矮的可能原因分析。提示： 转基因时，目的基因是通过T-DNA的整合作用把T-DNA的左右边界和其中间的目的基因和选择标记基因一起整合进受体细胞基因组中。T-left标记基因promoterT- right目的基因第50页/共59页植物组织中基因组DNA的提取原理： 用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（

19、并与蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉淀。第51页/共59页抽提质粒抽提质粒DNA所需的溶液：所需的溶液：、溶液溶液：50 mol/L葡萄糖，葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；、溶液溶液： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)， 现配现用；现配现用；、溶液溶液：3 mol/L KAc，用冰醋酸调，用冰醋酸调pH值至值至 5.2；第52页/共59页 DNA染色剂 荧光染色剂,溴化已锭：（ EB, Ethidium bromid）吸收300360nm UV（紫外光）放出590nm可见光（橙红色） 硝酸银：常用0.1% Goldview染料染料吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红色光（单链DNA）第