基因工程的常规技术

1、基因工程的常规技术影响琼脂糖凝胶电泳的因素： DNA片段的大小 凝胶的类型 凝胶的浓度 电泳缓冲液 电压第1页/共50页琼脂糖凝胶电泳装置： 第2页/共50页琼脂糖凝胶电泳装置：第3页/共50页凝胶成像分析系统： 第4页/共50页DNA电泳图谱 RNA电泳图谱 第5页/共50页n重组子：重组子： 2.7 kb + 4.0 kbn非重组子：非重组子： 2.7 kbpUC18 2.7kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZori4.0 kb2.7 kb5.4 kbL1 L24.0 kbPH第6页/共50页聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原

2、理示意图 第7页/共50页SDS-PAGE电泳图谱 第8页/共50页 1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。 概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。二 杂交技术第9页/共50页第10页/共50页核酸分子杂交的基本原理： 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。第11页/共50页 DNA-DNA杂交双链分子第12页/共50页DNA印迹技术 Southern blotting 基因组DNA经限制性内切

3、酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。第13页/共50页Southern Blotting: Gel Transfer第14页/共50页第15页/共50页Southern blot第16页/共50页RNA印迹技术 Northern blotting 与Southern blotting相似，但不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。 第17页/共50页酵母转化子Northern杂交结果第18页/共50页蛋白质免疫印

4、迹法 Western blotting: 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。n应用 1 检测样品中特异蛋白存在与否 2 细胞中特异蛋白的半定量分析 3 蛋白质分子相互作用的研究第19页/共50页原理：蛋白质组分经SDS-PAGE分离后，平行转移到固相支持体（NC膜或PVDF膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白。靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗结合一抗，然后HRP催化化学显色反应或化学发

5、光反应。第20页/共50页第21页/共50页三 PCR技术第22页/共50页PCRPCR技术的创建技术的创建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在体外经等提出在体外经DNADNA变性变性, ,与适当引物杂交与适当引物杂交, ,再再用用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。19831983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚

6、合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术技术 19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大科学发明之为十余项重大科学发明之首首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学年度诺贝尔化学奖。奖。第23页/共50页http:/第24页/共50页第25页/共50页无细胞分子克隆法：在微量离心管中, ,加入适量的缓冲液, , 微量的模板DNA,DNA,四种脱氧单核苷酸, ,耐热性多聚酶, , 一对合成DNADNA的引物, ,通过高温变性、低温退火和中温延伸三

7、个阶段为一个循环, ,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍, ,一般样品是经过3030次循环, ,最终使基因放大了数百万倍; ; 扩增了特异区段的DNADNA带。第26页/共50页第27页/共50页Polymerase Chain Reaction (PCR)第28页/共50页引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区, ,与非扩增区无同源序列。与非扩增区无同源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-30 bp15-30 bp为宜（为宜（17 1.517 1.510101010bpbp）。）。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占50-60

8、%50-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物3 3端为关键碱基；端为关键碱基；5 5端无严格限制。端无严格限制。第29页/共50页 总体积总体积 50-100 l Buffer 缓冲液缓冲液 dNTP 原料原料 Primer 引物（引物（0.1-0.5 mol/L） DNA分子分子 模板模板 （50-100ng ） Taq酶酶 DNA聚合酶（聚合酶（0.5-2.5 U/50 L ）反应体系：第30页/共50页经典循环参数：94 30s 55 45s72 1min 94 5min3

9、0次72 7min 4第31页/共50页第32页/共50页四 基因文库构建n基因文库的基本概念基因文库的基本概念n基因文库的构建程序基因文库的构建程序n基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序第33页/共50页基因文库（gene librarygene library）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）第34页/共50页基因文库构建的基本战略用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNAm

10、RNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNAcDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNAcDNA文库或胚胎组织cDNAcDNA文库等。用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA第35页/共50页基因文库的构建程序基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNADNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNADNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。第36页/共50页基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNADNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性

11、内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一第37页/共50页载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的-DNA-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YACYAC或BACBAC载体。 由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于10 kb10 kb，因此用于cDNAcDNA文库构建的载体通常选质粒。 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌。第38页/共50页从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编

12、码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。 第39页/共50页n 从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因密集铺板（密集铺板（1-10万）万）目的重组克隆目的重组克隆杂交取挖铺板铺板第40页/共50页作业： 简述基因工程实验中常规技术？第41页/共50页第42页/共50页Southern blot第43页/共50页http:/第44页/共50页http:/第45页/共50页http:/第46页/共50页四 基因文库构建n基因文库的基本概念基因文库的基本概念n基因文库的构建程序基因文库的构建程序n基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序第47页/共50页从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由