第18章 色谱法导论-32h

1、第第18章章 色谱法导论色谱法导论第一节第一节 概论概论v色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。v此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别

2、接得各种颜色的色素，并可分别继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。进行鉴定。色谱法也由此而得名。v玻璃管为色谱柱，玻璃管为色谱柱，管内的碳酸钙填料管内的碳酸钙填料为固定相，石油醚为固定相，石油醚淋洗液为流动相。淋洗液为流动相。v现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。原理仍然是一样的。v色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，能够分离性质相近的多组分复杂分离技术，能够分离性质相近的多组

3、分复杂混合物。混合物。v将色谱法用于分析化学并配合适当的检测手将色谱法用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。段，就成为色谱分析法。v色谱法分类色谱法分类v1.按固定相形态分类按固定相形态分类v柱色谱：固定相装在色谱柱内。包括填充柱、柱色谱：固定相装在色谱柱内。包括填充柱、整体柱、毛细管柱或开管柱。整体柱、毛细管柱或开管柱。v平面色谱：固定相呈平面状。包括薄层色谱平面色谱：固定相呈平面状。包括薄层色谱和纸色谱。和纸色谱。色谱法色谱法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法气气- -液色谱法液色谱法气气- -固色谱法固色谱法液液- -固色谱法固色谱法液液- -液色谱法液色谱法v2.按

4、两相的物理形态、分离机理分类按两相的物理形态、分离机理分类第二节第二节 基本概念基本概念v色谱分离体系由两部分组成：一相是固定不动的，色谱分离体系由两部分组成：一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。我们把它叫做流动相。v当流动相以一定速率流经色谱柱，试样中各个组分当流动相以一定速率流经色谱柱，试样中各个组分在流动相和固定相之间进行连续多次分配。在流动相和固定相之间进行连续多次分配。v组分与固定相和流动相之间的作用力有差别，因而组分与固定相和流动相之间的作用力有差别，因而组分在两相中分布常数不同。组分在两相中

5、分布常数不同。v在固定相上吸附力大的，在固定相上吸附力大的，即分布常数大的，迁移即分布常数大的，迁移数率慢，保留时间长；数率慢，保留时间长；在固定相上吸附力小，在固定相上吸附力小，即分布常数小的，迁移即分布常数小的，迁移数率快。数率快。v试样中各组分同时进入试样中各组分同时进入色谱柱，但是在不同时色谱柱，但是在不同时间从色谱柱中洗出，实间从色谱柱中洗出，实现分离。现分离。024681012024681002468101202468100246810120246810混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应v试样组分在色谱体系中运行的特

6、点：试样组分在色谱体系中运行的特点：v1.差速迁移：混合物中不同组分的迁移速率不同差速迁移：混合物中不同组分的迁移速率不同v差速迁移差速迁移(保留值的大小保留值的大小)取决于组分与固定相、流取决于组分与固定相、流动相作用力的差异动相作用力的差异v2.分子分布离散：同种组分分子在迁移过程中分布分子分布离散：同种组分分子在迁移过程中分布空间扩展空间扩展v分子分布离散取决于同种分子运动速率的差异分子分布离散取决于同种分子运动速率的差异v色谱分离要求：差异速率色谱分离要求：差异速率(保留值大保留值大)，分子分布离，分子分布离散散(色谱区带色谱区带)窄。窄。v2.分布平衡分布平衡v色谱涉及溶质在两相中的

7、分布平衡，平衡常数色谱涉及溶质在两相中的分布平衡，平衡常数K称称为分布系数或分配系数为分布系数或分配系数vK=cs/cmvcs是溶质在固定相的浓度，是溶质在固定相的浓度，cm是溶质在流动相中的是溶质在流动相中的浓度，浓度，K是溶质在两相中分布平衡性质的度量，反是溶质在两相中分布平衡性质的度量，反映溶质与固定相、流动相作用力差别。映溶质与固定相、流动相作用力差别。vK只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。和所用仪器无关。v温度、溶质一定时，温度、溶质一定时，K 主要取决于固定相性质。主要取决于固定相性质。v每个组份在各种固定相上的分配

8、系数每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；组分不同；组分的分配系数的分配系数 K 越小，出峰越快；组分的分配系数越小，出峰越快；组分的分配系数 K 越大，出峰越慢；某组分的越大，出峰越慢；某组分的K = 0时，即不被固定相时，即不被固定相保留，最先流出。保留，最先流出。v选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的分具有不同的K值是分离的基础；值是分离的基础；v3.色谱流动相流速色谱流动相流速v稳定的流动相流速是色谱系统正常运行的基本条件。稳定的流动相流速是色谱系统正常运行的基本条件。v流动相的流速通常有两种表达方式流动相的流速通常有两

9、种表达方式v体积流量体积流量Fc mL/min，单位时间流过色谱柱的平均，单位时间流过色谱柱的平均体积。体积。vFc采用容器收集柱后一定时间内流出流动相的体积采用容器收集柱后一定时间内流出流动相的体积进行测定。进行测定。v线速度线速度 cm/min，mm/min，单位时间内流动相流，单位时间内流动相流经色谱柱的长度经色谱柱的长度v 由柱长由柱长L和死时间和死时间tM求出，求出， =L/tMv4.色谱图色谱图v分离试样各组分依次进入分离试样各组分依次进入柱后，由检测器产生检测柱后，由检测器产生检测信号，响应信号大小对时信号，响应信号大小对时间或流动相流出体积的关间或流动相流出体积的关系曲线为色谱

10、图。系曲线为色谱图。v色谱图的横坐标是时间或色谱图的横坐标是时间或流动相体积，纵坐标是组流动相体积，纵坐标是组分在流动相中浓度或检测分在流动相中浓度或检测器响应信号大小，器响应信号大小，v色谱图是色谱分析的主要技术资料，色谱包含的色色谱图是色谱分析的主要技术资料，色谱包含的色谱信息谱信息v1.说明试样是否是单一纯化和物。正常色谱条件下，说明试样是否是单一纯化和物。正常色谱条件下，如果色谱图有一个以上色谱峰，说明试样中有一个如果色谱图有一个以上色谱峰，说明试样中有一个以上组分。色谱图能够提供试样中的最低组分数。以上组分。色谱图能够提供试样中的最低组分数。v2.说明色谱柱效和分离情况，可定量计算出

11、表征色说明色谱柱效和分离情况，可定量计算出表征色谱柱效的理论塔板数、评价相邻物质对分离优劣的谱柱效的理论塔板数、评价相邻物质对分离优劣的分离度。分离度。v3.提供各组分保留时间等色谱定性数据。提供各组分保留时间等色谱定性数据。v4.给出个组分色谱峰高、峰面积等定量数据。给出个组分色谱峰高、峰面积等定量数据。 色色 谱谱 图图 v基线基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。平直与

12、否可反应出实验条件的稳定情况。v色谱峰高色谱峰高(h)：色谱峰顶点与基线的距离叫峰：色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。高。v峰面积峰面积：色谱峰与峰底基线所围成区域的面：色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。积叫峰面积。v色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。率越高，分离的效果也越好。v区域宽度通常有三种表示方法：区域宽度通常有三种表示方法：v标准

13、差标准差 ：峰高：峰高0.607倍处峰宽处的一半。倍处峰宽处的一半。v半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354 v峰底宽峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。的距离。W= 4 。v5.保留值保留值v保留值是试样各组分在色谱柱或色谱体系中保留行保留值是试样各组分在色谱柱或色谱体系中保留行为的度量，反映溶质与色谱固定相作用力类型和大为的度量，反映溶质与色谱固定相作用力类型和大小，是色谱热力学参数和定性依据。小，是色谱热力学参数和定性依据。v比移值比移值Rf：溶质通过色谱柱的平均线速度：溶质通过色谱柱的平均线速

14、度u与流动与流动相平均线速度相平均线速度ux之比。之比。v溶质分子在流动相中消耗的时间分数等于溶质分子溶质分子在流动相中消耗的时间分数等于溶质分子在流动相中分布的分子分数，这样得到：在流动相中分布的分子分数，这样得到：vnm和和ns分别为溶质在流动相和固定相的分子数或物分别为溶质在流动相和固定相的分子数或物质的量。质的量。xmfmsunRunnv溶质在流动相中消耗的时间越多，溶质在流动相中消耗的时间越多，nm越大，越大，ux越大，越大，Rf也越大。也越大。v如果溶质在流动相中消耗时间分数为如果溶质在流动相中消耗时间分数为1，即溶质一，即溶质一直在流动相中迁移，未在固定相中停留，直在流动相中迁移

15、，未在固定相中停留，ux=u，Rf=1。v如果溶质一直停留在固定相，谱带不随流动相迁移，如果溶质一直停留在固定相，谱带不随流动相迁移，则则ux=0，Rf=0。v通常，通常，0Rf1.5, R1.5, R增加不大增加不大) ) 。 改变改变 的方法有：降低柱温、改变流动相及固的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。定相的性质和组成。 v3）分离度）分离度R 分配比分配比 k 的关系的关系v k 增加，分离度增加，分离度R 增加，但当增加，但当k10，则，则R的的增加不明显。通常增加不明显。通常k在在210之间。之间。 v 改变改变 k 的方法有：适当增加柱温的方法有：适当增加柱温(G

16、C)、改变、改变流动相性质和组成流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。以及固定相含量。70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂溶剂( (流动相流动相) )组成对色谱分离的影响组成对色谱分离的影响( (梯度淋洗梯度淋洗) )1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,10-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改变组成

17、使 k 最佳3.3.分析时间分析时间 t t 分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。其分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。其值为值为2322222(1)16()1RkHtRuk可见，分析时间与可见，分析时间与R R， ，k k、H/uH/u等参数有关。等参数有关。R R 增加增加1 1 倍，分析时间则是原来的倍，分析时间则是原来的 4 4 倍。倍。 实际工作中，即要能获得有效的分离，又要实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。在较短时间内完成分析。例：两物质例：两物质A A和和B B在在30cm30cm长的色谱柱上的保留时间分别为长的色谱柱上的保留时间分别为16.416.

18、4和和17.63min17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为上的保留时间为1.30 min1.30 min。物质。物质A A和和B B的峰底宽分别为的峰底宽分别为1.111.11和和1.21min1.21min。试问：。试问：1 1）柱分辨率）柱分辨率R R；2 2）柱平均理论塔板数）柱平均理论塔板数n navav3 3）平均塔板高度）平均塔板高度H Havav4 4）若要求）若要求R R达到达到1.51.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？5 5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？）使用上述较长的柱进行分析

19、时，其分析时间为多长？6 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R R达到达到1.51.5，该柱，该柱的塔板高度应为多少？的塔板高度应为多少？1 1）柱分辨率柱分辨率R R；2(17.63 16.40)min1.06(1.11 1.21)minsR232333316.4016()3.49 101.1117.6316()3.40 101.21(3.49 103.40 10 )/23.44 10ABavnnn 2 2）柱平均理论塔板数柱平均理论塔板数n navavv3）平均塔板高度平均塔板高度Hav33308.7 103.44 10avLHcmn,:kLH 或

20、与柱长 或塔板高度 无关 因此可得到1122nRRn321.063.44 101.5n即326.9 10n 因此336.9 108.7 1060Ln Hcm4 44 4）若要求若要求R R达到达到1.51.5，则柱长至少应为多少？，则柱长至少应为多少？5 5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？时间为多长？221122222( )17.631.06()( )( )1.5( )35minrrrrtRtRtt23216(1)t()1,R Hkuk由式B得到 物质在两柱上分析时间之比,本题要求在达到相同分辨率条件下 分析时间相等2r11r22(t )()

21、1(t )BBRHRH代入各值得-324.3 10Hcm6 6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R R达达到到1.51.5，该柱的塔板高度应为多少？，该柱的塔板高度应为多少？第五节第五节 色谱方法选择色谱方法选择v方法选择方法选择v根据试样物理、化学性质和分析要求来选择色谱方根据试样物理、化学性质和分析要求来选择色谱方法：法：v各种气体、沸点各种气体、沸点500以下具有挥发性的试样，采以下具有挥发性的试样，采用气相色谱分析。用气相色谱分析。v非挥发性试样，包括有机物、无机物、高分子化合非挥发性试样，包括有机物、无机物、高分子化合物、可解离化合物采用高效液相

22、色谱分析。物、可解离化合物采用高效液相色谱分析。v薄层色谱为非仪器分析方法，为高效液相色谱流动薄层色谱为非仪器分析方法，为高效液相色谱流动相、固定相选择的辅助手段。相、固定相选择的辅助手段。第六节第六节 色谱分析色谱分析v1.定性分析定性分析v色谱定性：鉴定试样中各组分，即每个色谱峰是何种化色谱定性：鉴定试样中各组分，即每个色谱峰是何种化合物。合物。v基于色谱分离的主要定性依据是保留值，包括保留时间、基于色谱分离的主要定性依据是保留值，包括保留时间、保留体积、相对保留值等。保留体积、相对保留值等。v色谱保留值色谱保留值与分子结构有关，可以用来鉴定已知物。与分子结构有关，可以用来鉴定已知物。v如

23、在同样色谱条件下，用已知化合物与试样中色谱峰对如在同样色谱条件下，用已知化合物与试样中色谱峰对照定性；将已知化合物加入试样中，导致某色谱峰增高照定性；将已知化合物加入试样中，导致某色谱峰增高来定性。来定性。v应用保留值确定试样中不存在某个化合物是可靠的，而应用保留值确定试样中不存在某个化合物是可靠的，而准确鉴定某一色谱峰是某个化合物，需要反复验证。准确鉴定某一色谱峰是某个化合物，需要反复验证。v保留指数保留指数也是一种相对保留值，保留指数在固定液也是一种相对保留值，保留指数在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指标。它具有重现性好

24、、标准统一及温度系的定性指标。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。数小等优点。v它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数它是把正构烷烃中某两个组分的调整保留值的对数作为相对的尺度。保留指数仅与固定相的性质、柱作为相对的尺度。保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性温有关，与其它实验条件无关。其准确度和重现性都很好。只要柱温与固定相相同，就可应用文献值都很好。只要柱温与固定相相同，就可应用文献值进行鉴定，而不必用纯物质相对照。进行鉴定，而不必用纯物质相对照。v2.定量分析定量分析v定量依据是根据检测响应信号大小，测定试样中定量依据是根据检测响应信号大小

25、，测定试样中各组分的相对含量。各组分的相对含量。v定量分析的依据是每个组分的量与色谱检测器的定量分析的依据是每个组分的量与色谱检测器的响应值成正比，与峰高或峰面积响应成正比。响应值成正比，与峰高或峰面积响应成正比。v每个色谱峰高每个色谱峰高h可从色谱图直接测定，色谱峰面积可从色谱图直接测定，色谱峰面积A以峰高与半峰高宽以峰高与半峰高宽2W1/2相乘求出相乘求出: A=h 2W1/2v在试样和标样平行分析时，必须严格控制柱温、在试样和标样平行分析时，必须严格控制柱温、流动相流速、进样速度等条件，才能获得准确的流动相流速、进样速度等条件，才能获得准确的峰高测定结果。峰高测定结果。v标准校正法标准校正法v配制一系列组成与试样相近的标准溶液，按标准溶配制一系列组成与试样相近的标准溶液