基因工程期末复习材料

1、名词解释1 .基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNM段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。2 .基因克隆：指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，目的在于获得大量的基因拷贝3 .载体：将外源基因引入宿主细胞进行复制或表达的运载工具。4 .受体细胞：能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞。5 .限制性内切核酸酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核甘酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。6 .黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构

2、。7 .平末端：限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端。8 .同裂酶：指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。9 .同尾酶：指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同黏性末端的限制性内切核酸酶。10 .酶的星号活性：当条件改变时，许多限制酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性的现象。11 .DNA连接酶：是一种能够催化双链DNA±彼此相邻的3'-OH和5'-P形成磷酸二酯键的核酸酶。12 .DNA聚合酶：是指在引物和模板的存在下，将dNTP1续地加到双链DNA分子引物链的3'-OH末端，催化核甘酸聚合作用的酶。13

3、 .反转录酶：依赖RNA勺DN咪合酶（RNA指导的DN咪合酶）14 .克隆载体：用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。15 .表达载体：可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。16 .穿梭载体：可在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达的载体17 .质粒：是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可自主复制和表达。18 .质粒的拷贝数19 .质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中细胞不能共存的现象。20 .“-互补：lacZ基因产物分为a链和3链两部分，只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为a-互补作用。21 .插入失活：在一个基因

4、位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象。22 .多克隆位点（MCS:包含多个单一限制性酶切位点的一段很短的DN际列。23 .琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖为支持物，在适当的条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DN册子的分离、纯化和鉴定。24 .Southern杂交：是先将分布在琼脂糖凝胶上大小不同的变性DNA片段转移到滤膜上，之后通过碱基互补配对，将滤膜与探针杂交，显色鉴定。25 .探针：指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。聚合酶链式反应：是以DNW模板，在引物指导下由DNA聚合酶催化的对特定基因片断进行的体外扩增反应。26 .引物：预扩增核酸片段

5、两端的已知序列，决定特异性。27 .简并引物：由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，称之为简并序列。相应合成这一段序列作PCFT增体系的引物。28 .目的基因：是基因工程中克隆的目标DNA分子，是一段特定序列的DNA片段，而并不一定是具有基因完整功能区的分子。29 .基因文库：又称DNAC库，是指某个生物的基因组DNAecDNA段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过筛选获得大量的阳性菌落（或噬菌斑），所有菌落或噬菌斑的集合即为该生物的基因文库。30 .基因组文库：是将某一生物基因组DNM段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称，包含了这一生

6、物的全部遗传信息。31 .cDNA文库：是将生物特定的组织器官或发育时期的全部mRN©转录成cDNA并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。32 .衔接物：用化学方法合成的一段8-12nt的含有一个或数个特定限制酶识别位点序列的平端双链。33 .转化：指以质粒为载体，将外源DNAt入处于感受态的E.coli等原核宿主细胞，并使其获得新表型的过程。34 .感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子生理状态的细胞35 .感染：将以入噬菌体DNW载体的DNAM组分子包装成病毒颗粒感染受体菌的过程；由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transductio

7、n）。36 .转染：即转化与感染相结合，以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNA1接酶使噬菌体DNA化，再通过质粒转化方式导入受体菌。37 .重组子：含有重组DNA分子的转化子。38 .筛选：经过各种方法将外源DN酚子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。39 .阅读框架：是基因的编码区，包含从起始密码子至终止密码子之间的cDNA序列。40 .启动子：是RNAM合酶识别、结合并起始转录的一段DN际列。41 .增强子：是远距离调节启动子并提高转录效率的一段DN际列。42 .终止子：是为转录提供终止信号的一段DNA列。43 .沉默子：是远距离调节启动子以降低转录

8、速率的一段DN际列。44 .操纵子：由数个功能相关的结构基因及其调控区（操纵基因、启动子及其它有调控功能的单位）组成。45 .复制子：是一段包含复制起始位点和反式因子作用区在内的DNA区段。46 .植物转化受体系统：指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。47 .胚胎干细胞：是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、具有正常二倍体和发育全能性的细胞。48 .细胞核移植技术：是将一个体细胞核移植到另一个体的卵细胞中去，最终产生一个与供体细胞个体遗传性状一致的动物个体的技术。P223-22449 .基因治疗：是指向

9、目的细胞引入正常功能的可表达的基因，从而修正由于基因缺陷所造成的遗传性疾病。50 .分子标记：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNAt段，表现为核甘酸序列的任何差异，哪怕是单个核甘酸的变异。问答及填空：1 .基因工程的技术流程：?目的基因克隆?载体的准备?目的基因与载体的连接?重组DNA专化/转染/转导?重组体的筛选与鉴定?重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用2 .基因工程的基本条件：目的基因、载体、工具酶、受体细胞(宿主细胞)3 .基因工程的技术策略：(1) .强化基因的表达，改善生物性状(2) .关闭特定基因的表达，改善生物性状(3) .基因的异源表达赋予生物新的功

10、能(4) II型限制性核酸内切酶命名原则：1 .用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌(Escherichiacoli)用Eco表示；流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。2 .若该菌有不同的变种或品系，再加上变种或品系的第一个字母，如EcoRI。3 .如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示，如EcoRI,EcoRV。4 .限制酶前面要带上R(Restriction),修饰酶前面要带上M(Modification)。(现已省略)5 .产生星活性的原因及影响其酶活性的因素?导致星号活性发生的因素

11、高甘油含量(>5%,V/V);限制酶用量过大(>100U/科gDNA);低离子强度(<25mmol/L);高pH(>pH8.0);含有机溶剂(如二甲基亚碉、乙醇、二甲基乙酰胺等)；Mn+、Cu2+、Co+>Zn2+等非M的二价阳离子存在。?抑制星号活性的方法尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；尽量避免有机溶剂的污染；将离子浓度提高到100-150mM将反应缓冲液的pH值降到7.0;2+二价离子用Mg。6 .DNA连接酶的种类及作用特点种类：大肠杆菌DNA1接酶、T4DNA1接酶、嗜热菌DNA1接酶DNA1接酶催化的连接反应特点连

12、接反应发生在一条DNA链白3'-OH端和另一条DNA链白5'-P端之间；连接反应需要ATP或NADMg2+作为辅助因子与激活因子；DNA1接酶不能催化两单链DN6子或环化单链DNA子的连接；只能连接双链DNA分子的单链缺口(nick),不能连接双链中的裂口(gap)。7 .常见工具酶的用途如：DN咪合酶：补齐5'-突起端?合成第二条cDNA?除去3'-端突起的单链DNA(在无dNTP时)?切口移位制备探针反转录酶：?以mRN朋模板合成其互补的DNA(cDNA)用于构建cDNA和基因克隆；?对具5'端突出的DNA段的3'凹端进行补平和标记，制备杂交

13、探针；?代替Klenow片段或测序酶，用于DNA列分析。碱性磷酸酶：?DNA或RNA分子片段5'末端的去磷酸化，防止自身连接；在5'端标记之前，去除DNA或RNA分子的5'末端磷酸基团。%-32末端转移酶：?用于克隆DNM段，给载体和外源DNA3'末端分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。?用于DNA片段3'末端标记，催化a-32P-3'-脱氧核甘酸标记DNA片断的3'末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入到DNA片断的3'-末端。?按照模板合成多聚核糖核昔同聚物。多核甘酸激酶：?DNA5端磷酸化?标记DNAeRNA勺5&

14、#39;端8 .质粒的基本性质：自主复制性、不相容性、转移性、携带特殊的遗传标记9 .理想质粒载体的必备条件和质粒载体人工构建的策略理想质粒载体的必备条件：?具有较小的分子质量和较高的拷贝数；?具有尽可能多限制酶的单一酶切位点；?具有两种以上的选择标记基因；?缺失mob基因；?插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。质粒人工构建的策略P39-40?加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择；?增加或减少合适的酶切位点，便于重组；?缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量；?改变复制子，变严谨为松弛，变少拷贝为多拷贝；?根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。10

15、 .入和M13噬菌体的性质入噬菌体的性质?是E.coli的温和型噬菌体。?入噬菌体颗粒中的DNA是一线性dsDNA分子，两端各有12个碱基(5'-GGGCGGCGACCT-)的5'凸出黏性末端是互补的。进入细菌细胞的入DNA通过两端的黏性末端配对形成环状的dsDNA这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点(cohesiveendsite)。?含有60多个基因，整个基因组分为三部分11 .入噬菌体载体的构建与类型、各种载体承载量的大小。噬菌体载体的构建：?缩短长度，提高装载量；?删除重复的酶切位点，增加一些单一的酶切位点；?加装选择标记（免疫功能类标记和颜色反应类标记）；?

16、构建琥珀密码子的突变体。噬菌体载体的类型：P44-45插入型载体：载体长度37kb,插入片段大小0-14kb（51-37）置换型载体：载体长度26kb,最小装载长度10kb（36-26）,最大装载长度25kb（51-26）12 .提取和纯化DNA的步骤主要有：细胞裂解和DNA勺溶解与保护；去除与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质；DNA的沉淀和纯化。13 .如何检测、评价提取的DN颇量：（一）紫外分光光度法测定DNARNA的浓度和纯度?DNARNA链上碱基的苯环结构在260nm处有特异的紫外吸收峰，吸收强度不仅与它们总含量有关，还与它们的分子形状、单双链有关。?可用OD60/OD280值衡量DNA

17、/RN掰纯度?纯DNA勺OD60/OD280应为1.8,大于1.9表明有RNA亏染，小于1.6表明有蛋白质或酚污染；同时OD60/OD230应大于2.0，小于2.0表明溶液中有残存的多糖、盐和小分子杂质等。?纯RNA勺OD60/OD280应介于1.7-2.0之间，小于1.7说明有蛋白质或酚的污染，大于2.0表明有异硫鼠酸月瓜残存；同样OD60/OD230应大于2.0，小于2.0表明有小分子及盐和多糖存在。?（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定?（三）核酸的保存14 .DNA电泳的影响因素：?DNA子大小：分子越大，泳动越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。?DNA子构型：超螺旋环状线状切口环状

18、。?凝胶浓度：浓度越高，电泳速率越慢；浓度低的胶线性范围较宽，浓度高的胶对小分子DNA较好的线性关系。?电场强度：强度高，电泳速度快，但分辨率低。?凝胶和电泳缓冲液中的澳化乙锭（EB）:插入dsDNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。对超螺旋的DNA分子影响较大。15 .分子杂交的主要技术的原理、步骤及用途，探针的制备方法分子杂交的基本原理：具有互补特定核甘酸序列的ssDNA或RNA昆在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物予以标记，当作探针（probe）,与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。再用合适方法把标记物检测出来，

19、就可确定靶核甘酸序列的拷贝数及表达丰度等。探针制备的方法：1.均匀标记：（1）切口平移法标记、（2）随机引物法（6核甘酸引物标记法）、（3）PCFT增标记2.末端标记：5'末端标记法、3'末端标记法、T4聚合酶替代法。16.PCR技术的原理、步骤、体系及引物设计的原则PCR术的原理：（变性、复性、半保留复制）在有DNAII链、与DNA链互补的寡核甘酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DN咪合酶的催化作用下即可进行DNA单链的5'-3合成反应。PC破术的基本过程P79?DNAII板的变性（denatureation）:将待扩增DN劭口热

20、到95c左右，使dsDNAM开成为单链并作为模板；?模板与引物的结合（退火annealing或复性）：将体系温度降至合适温度（55C左右），使加入的引物与模板DNA两端碱基序列互补结合；?引物延伸（extension）:将体系温度升到72c左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3'端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。PC阪应的成分：1.缓冲?夜,2.MgCl2,3.dNTPs,4.引物，5.模板DNA6.TaqDNA聚合酶引物设计的3条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合

21、反应（即错配）。17 .基因文库的分类及操作步骤分类：外源DNA段、载体、宿主基因组DNA文库的构建程序：?高纯度大相对分子质量基因组DNA勺提取和大片段的制备；?高纯度基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；?载体DNA的制备；?载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；?重组克隆的挑选和保存。18 .基因组DNAC库与cDNA文库的优缺点?cDNA文库的优点（与基因组文库相比）P116-117cDNA克隆以mRN朋材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离；cDNA文库的筛选比较简单易行；假阳性的概率比较低；cDNA克隆可进行原核表达；cDNA克隆还可用于真核细

22、胞mRNA勺结构和功能研究。?cDNA文库的缺点（与基因组文库相比）包含的遗传信息要远远少于基因组DNAt库，并且受细胞来源或发育时期的影响；不能直接获得基因内含子序列和调控序列的结构与功能信息，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列；cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA勺分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNAjcDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难。19 .外源DNA段与载体DNA段连接方式：一、黏性末端的连接（一）同一种酶产生的黏性末端的连接（二）不同种酶产生的黏性末端的连接二、平末端的连接1 .直接连接2 .人工加尾形成“

23、粘性末端”(1)同聚加尾法(2)衔接物(linker)连接法(3)接头(adapter)分子连接法三、PCR产物的连接1 .引入酶切位点连接法2 .T-A克隆法20 .CaCl2法制备细胞感受态转化重组DNA的原理及步骤。?原理：细菌处于0c的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀成球形，DNAWCa2+结合形成抗DNase的复合物粘附于细胞表面，经42c短暂热击后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞。P139细菌感受态细胞的制备过程(CaCl2):21 .重组子的筛选与鉴定的方法与原理，尤其是插入失活法、P-半乳糖甘酶显色法和核酸杂交法一、载体表型选择法:P152-1531 .抗药性标记插入失活选择

24、法2 .3-半乳糖甘酶显色反应选择法二、根据插入基因的表型选择法?原理：外源DN廊码的基因对宿主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的宿主细胞表现出外源基因编码的表型特征三、DNA电泳检测法四、PCR佥测法?原理：PCRt归在模板序列上扩增出预期DNM断。五、核酸杂交检测法?原理：利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。六、免疫化学检测法P154-155?原理：利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。22 .影响外源基因表达的因素：一、阅读框架对转化基因表达的影响二、顺式作用元件对转化基因表达的影响三、翻

25、译过程对表达的影响四、表达系统对表达产物的影响23 .原核与真核生物基因表达与调控的特点原核生物基因表达调控的特点：1 .原核生物基因表达以操纵子为单位。2 .原核生物只有一种RNA聚合酶。3 .原核生物无核膜，转录和翻译过程是偶联的。4 .原核生物基因一般不含内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。5 .原核生物基因表达的调控主要在转录水平真核生物基因表达调控的特点：1 .基因组DNA勺存在形式可影响基因表达，其基因的表达调控比原核生物要复杂得多；2 .真核基因的转录和翻译不是偶联在一起的；3 .真核基因表达的调控是多层次的；4 .基因表达具有组织和细胞类型特异性；5 .不同的真核

26、细胞在基因表达调控中对信号分子的反应不同。24 .了解植物、动物和微生物基因工程的应用植物基因工程的应用（一）在植物遗传改良中的应用（二）作为药物生产的反应器动物基因工程的应用1 .利用转基因技术改良动物遗传性状2 .利用转基因动物生产生物大分子3 .异种器官移植4 .利用转基因技术构建医学动物模型5 .基因治疗微生物基因工程的应用（一）微生物基因工程在农业领域的应用（二）微生物基因工程在工业领域的应用（三）微生物基因工程在药物生产上的应用（四）微生物基因工程在环境保护上的应用25 .常见分子标记的种类、原理?分子标记的类型Hibridization-basedmarkers以分子杂交为基础的

27、DNAj示记技术（RFLP标记、DNA旨纹技术、原位杂交）PCR-basedmarkers以PCR反应为核心的分子标记技术（RAPD记、SSR标t己、SSLP标t己、SCARCE、AFLP标t己、STS标t己）Sequencingbasedmarkers新型的分子标记（SN%H己、EST标记）1 .限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）?原理：DNA序列上的微小变化，可能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。2 .随机扩增多态性DNAfe记（randomamplifiedpolymorphicDNA,RA

28、PD）?原理：用一个随机引物（8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA然后用凝胶电泳分开扩增片段。3 .扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）?原理：先将基因组DNAffi两种限制酶切成大小不等的片断，并与含有粘性末端的人工接头相连，形成不同酶切位点的限制性酶切片段，然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增，预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板，再选用特异引物进行选择性扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。4 .简单重复序列（simplesequencerepeat,SSR）?原理：根据两端序列的保守性，设

29、计引物；进行PCR电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性。一、名词解释（10个，20分）二、填空题（20分，每空1分）三、单项选择题（10题，10分）四、判断题（10题，10分）五、简答题（30分，每小题6分）六、论述题（1题，10分）第二章填空题1 .枯草芽抱杆菌蛋白酶；（1）543'合成酶的活性；（2）345'外切核酸酶2 .碱性磷酸酶；5'端的磷酸基团3 .DNA聚合酶I:5'f3'外切核酸酶；5'f3'合成酶4 .S1核酸酶切割；DNA聚合酶补平5 .核酸水解酶H;RNA6 .5'-3舍成酶；3'-5'外

30、切核酸酶选择题1.b;2,b;3.b,c,d,e;4,b;5.d;6.b;7,a;8.a;9.d;10.b;11.d;12.abc;13.a,b;14.a；15.c；16.d;17.c；18.B;19.D;20.D;21.D第三章1 .质粒载体、噬菌体载体、质粒-噬菌体混合载体（或克隆载体、表达载体、整合载体）2 .复制区、选择标记、克隆位点3 .缺少选择标记，克隆位点4 .（1）分子量大（2）酶的多切点（3）无选择标记5 .75%105%6 .T-DNA区；Vir区；Con区；Ori区7 .b;8.b;9.a,c,d,e;10.d20.答:这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码3-半乳糖甘酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG（异丙基-3-D-硫代半乳糖甘）可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的3-半乳糖甘酶竣基端的一个蛋白片段互补（口-互补）。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在