微生物检测方法

1、沉积物微生物生物量氮测定方法方法：吕方恿蒸提取法概述：微生物生物量氮指沉积物中体积5000umT微生物体内氮的总和（包括活的死的微生物体，不包括活体植物根系），是沉枳物中有机氮中最活跃的组分，化学组成人部分是蛋白质和多肽类物质,c/N值5-6。微生物量氮一般占全氮含量的百分之一到百分之五，与沉积物水解性氮含量比较一致。沉积物微生物量氮是沉积物氮素转化的重要坏节，也是沉积物中有机-无机氮转化关键的坏节之一，含量可反映沉积物供氮能力的大小。碳与氮含量的比值与沉积物中TOC/TN比值有显著相关关系。研究其是评价微生物量和活性重要参数指标。相关研究主要测定了沉积物中微生物生物量氮的含量，可为进一步评价

2、沉积物中微生物生物量氮生物有效性及其在沉积物氮循环中的作用提供科学依据。方法原理：沉积物样品经过氯仿熏蒸以后，矿化速率加快，能被0.5mol/LKCL提取的氮量明显增加。假定恿蒸对非生物有机组分的矿化速率或可提取性的影响可以忽略，则根据恿蒸沉积物提取液中氨氮的增量可估算出沉积物微生物量氮的含量设备与实验条件1）分析天平：精确度O.OOOlg2）紫外可见分光光度计3）真空干燥器4）真空泵5）恒温振荡器6）通风橱7）烘箱试剂及操作步骤试剂：1）0.5mol/l的KCL：准确称取氯化钾37.275g溶于水中，稀释至1L2）酒石酸钾钠溶液3）納氏试剂4）技标准储备溶液：取3.8190g经100摄氏度干

3、燥过的优级纯氯化技溶于水中，定容至1000ml（每亳升此溶液含lg氨氮）5）技标准使用溶液：5ml®标准储备液，定容至500ml（每亳升含O.Olmg氨）操作步骤（1）标准曲线的制作1）7支25ml的比色管，加入0,0.25,0.5,1.5,2.5,3.5,5.0ml钱标准使用液，加水定容10ml再加入0.5ml酒石酸钾钠,0.75ml的纳氏试剂，混匀定容25ml,十分钟后在波长420nm处，以超纯水为参比，测吸光度。由测得的吸光度减去零浓度空白吸光度后，得到校正吸光度,绘制以氨氮含量mg对校正吸光度的标准曲线。（2）样品测定氯仿熏蒸处理在低温下保存的沉积物样品从冰箱中取出，室温再称

4、取，称取5g新鲜沉积物样品到50ml的小烧杯中，置于真空干燥器内，干燥器底部预放一张湿润粗滤纸保持湿度，真空干燥器内放置装有氯仿的小烧杯，烧杯内放置几粒无水氯化钙防止爆沸。少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至干燥器内氯仿沸腾，关闭真空干燥器阀门，在25摄氏度暗处放24小时，恿蒸完成后，打开干燥器阀门，取出氯仿烧杯，用真空泵反复抽真空，打开干燥器去除沉积物中残留的氯仿。称取同样质量的一份样品置于100ml离心管中，不熏蒸作为对照。B. KCL浸提恿蒸结束后，用0.5mol/lkcl25ml将沉积物转移到100ml离心管中，振荡30min/（转速200r/min,温度25摄氏度）用混纤膜过滤，对照

5、沉积物也同样处理C. 测定分析取2.5ml上述浸提液于50ml的比色管中,定容到25ml,+0.5ml的酒石酸钾钠溶液，30秒后+0.75ml的纳氏试剂摇匀后显色十分钟D. 比色超纯水做参比，420nm测其吸光度（测样时每侧一个样就用超纯水冲洗2到三遍）要在45min内测完注意点：测定值受沉积物水分状况影响很人，采用风干土，测定值显著降低，恿蒸前湿润沉积物则测定值增大；可以将沉积物样品转换成干样计算。直接应用文献报道的转换系数时注意沉积物性质及测定条件町比性结果计算沉枳物微生物屋氮含量的测定，根据测试指标带入以I、公式B（mg/kg）=F/KB微生物量氮F恿蒸不熏蒸土壤提取液氨氮含屋的差值；K

6、转换系数0.45沉积物反硝化细菌测定方法反硝化作用将陆地和水生态系统中的沉枳物、水体、土壤、植被等氮库中的氮转化成气态归还到大气圈的主要途径反硝化细菌主要通过诱导产生硝酸还原酶和呀硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原能消除污水中的氮，同时又消除了含氮的有害物质。是一类兼性厌氧微生物，有分子态氧存在时可化解有机物，利用其作为最终电子受体，无分子态氧存在下，反硝化菌利用硝酸盐亚硝酸盐作为电子受体，有机物作为碳源及电子供体提供能量。有助于研究反硝化脫氮除鳞技术，减轻水体中氮磷污染及其恢复环境PH的稳定性，还可揭示其在富营养化水体中脱氮除鳞性能提供理论依据方法原理反消化过程对于硝酸根离子消耗速率显著犬

7、于土壤其他生物化学过程对硝酸根离子利用。因此通过适宜的培养条件卜，测定介质中硝酸根离子和亚硝酸根离子消失量，利用最人町能计数法初步估计反硝化微生物数量。设备及实验条件：1）分析天平：精确度O.OOOlg2）高压蒸汽灭菌锅3）酒精灯4）超净工作台5）恒温培养箱6）烘箱7）移液管：100-1000ul试剂and操作步骤试剂1）奈氏试剂：2g碘化钾溶于5ml蒸馆I水。加入32gHgl2颗粒溶解饱和为止；将12.4gKOH溶于40ml蒸饰水中。将此溶液倒入Hgl2溶液中,加水到100ml.2）格里斯试剂：0.5g对氨基苯磺酸加到150ml20%稀乙酸溶液中；将lga-蔡胺加到20ml蒸懈水和150E2

8、0%稀乙酸溶液中，混合两液3）二苯胺试剂：0.5g二苯胺溶于20ml蒸懈水以及100ml浓硫酸中21）每支试管（1.8cmxl8cm）中装入10ml培养基（深层培养，造成厌氧条件，培养基成分及其含量见表6-1）在培养基倒放一小根玻璃管（杜氏发酵管）121摄氏度卞灭菌30min2）选取五个桶释度（10A-7-10A-3）沉积物悬液，每一稀释度的悬液接种四支试管，每管接种1ml。另取四支培养基不接种悬液而接种无菌水作为对照。3）将接种好的试管与28摄氏度培养4D后，检查有无细菌，如有培养液会变浑浊甚至有气泡出现4）吸取1或2滴培养液于白瓷板孔中，加入1,2滴奈氏试剂后出现棕红色或浅褐色沉淀表明培养

9、基有氨产生。用格里斯试剂和二苯胺分别检查是否有亚硝酸和硝酸的产生5）对反硝化细菌进一步分离和纯化，町吸取培养液lml到新鲜培养液中富集培养，必要时可反复两次富集培养。吸取浓缩10倍的反硝化细菌培养液2ml,加入到经紫外线消毒的硅胶板上，涂匀置于40摄氏度恒温箱中干燥至平板表面无积水，然后将富集培养的样品进行悬液接种培养。14D后观察菌落生长的情况，并纯化单菌落6）如需镜检取无菌吸管一支，用手指压紧瓶II,放入培养瓶底部，在松手，此时培养液会自动吸入，取出后涂片，用革兰氏染色后镜检，一般用酒石酸钾钠作为碳源的多位革兰氏阴性菌注意要点试验中吸管培养皿在实验开始前做灭菌处理吸管每次吸取悬液时，在稀释

10、液中反复吸入吸出悬液3-5次以减少因管壁吸附而造成的误差，使悬浮液进一步分散结果计算每克干土菌落数二菌落平均数x稀释倍数X20/干土所占百分比反硝化速率测定方法乙烘抑制法（AIT法）方法原理在一个密闭的系统里利用乙烘阻碍N2O向N2的转化，测定一定时间内N2O浓度的增加，来反映沉积物反硝化速率，单位时间内N2O生成量为反硝化速率设备and实验条件1）分析天平：精确度O.OOOlg2）恒温培养箱3）气相色谱仪4）乙烘，惰性气体，厌氧瓶，气袋，氧化亚氮标气等。试剂和操作步骤培养称取5g新鲜沉积物样品到厌氧瓶中，每个样品称取两份，然后添加上覆水15ml混合后拧紧瓶盖，其中一份冲入氮气lOmin（A组

11、）一份冲入氮气lOmin后加入乙lmin.然后将所有样品放入恒温箱中（20摄氏度）避光密闭静置培养12h2）采气培养结束后从瓶中抽取约50ml气体样品到气袋中用于分析氧化亚氮的含量3）测定取5ml的气样，用气相色谱仪分析样品氧化亚氮的含量注意要点充分排出瓶内原有空气，充气时乙烘从A进B出，氮气与之相反实验前检查装置的气密性每组样品做两份平行样尽量提高乙快的纯度，避免混入丙酮和一氧化碳影响实验结果。计算表观反硝化速率=A组氧化亚氮含量/培养时河x沉积物鲜重净反硝化速率=B组氧化亚氮含量/培养时间x沉枳物鲜重9.1沉积物氮磷释放动力学研究方法方法概述：沉积物中氮磷的释放对湖泊富营养化有着不町忽视的

12、作用。沉枳物中氮磷的释放是氮磷在沉积物一水体重新分配并达到平衡的过程，释放过程分为快速释放阶段，缓慢释放阶段，平衡阶段。沉积物中氮磷的释放动力学特征与沉积物的组成特征关系密切，其中与总氮总磷和有机质含量、磷氮形态以及与沉积物理化性状之间有显著的关系。沉积物中氮磷释放特征参数表征内源释放潜能的重要指标。相关研究主要测定氮磷释放动力学参数k（反应速率常数，其值人小标志沉积物释放磷强度）Qmax（最人磷释放量，沉积物磷释放的能力）以其进一步揭示湖泊沉积物对富营养化发生的影响机制提供理论依据。方法原理氮磷等营养盐在沉积物水体存在释放和吸附两种行为，当沉积物氮磷向间隙水中扩散使得间隙水中氮磷浓度高于上覆

13、水体时，沉积物氮磷向上覆水体释放，即释放前期快速释放阶段，随着释放量增加，水体中氮磷会向沉积物中迁移，释放和吸附同时进行阶段，总体是以释放为主的慢释放阶段，最后沉积物与水体氮磷释放和吸附达到平衡，即平衡阶段。测定不同时间段沉积物释放氮磷量，用释放时间和释放量建立一级动力学反应模型，即得动力学方程和动力学参数，描述沉积物氮磷释放特征。沉积物氮磷释放遵循一级动力学模型:lnq=b+klnt,q为t小时沉积物磷释放量（P,mg/kg）t是时间，b,k为常熟，k的人小标志沉积物释放磷的强度。通过对一定量的沉积物连续时间间隔取样，测定滤液中SRP浓度，绘制磷释放量对数与释放时间对数的曲线，按照上述方程拟

14、合，求出常熟b和k需要的设备与实验条件分析天平，精度0.OOOlg紫外可见分光光度计离心机恒温振荡器所需试剂和操作步骤磷所需试剂10$抗坏血酸：10g抗坏血酸用水溶解定容100ml到棕色试剂瓶低温保存，使用时颜色变黄要重配钳酸盐溶液：13g于100ml水中。0,35g酒石酸铢氧钾100ml水中。不断搅拌，将钳酸技溶液徐徐加到300ml（1+1）硫酸中，+酒石酸怫氧钾溶液，混合均匀，棕色瓶中4摄氏度保存，至少保存2个月0.02mol/lkcl溶液磷酸盐储备液：优级纯磷酸二氢钾到110摄氏度干燥2h,在干燥瓶中放冷，称取0.2197g,溶解到100ml容量瓶中，+（1+1）硫酸5ml用水桶释到标线

15、磷酸盐标准溶液:取10ml磷酸盐储备液用水定容至250ml,每亳升此溶液含2ug磷，现配先用操作步骤A. SRP标准曲线取25ml比色管7支，分别吸取磷酸盐标准液0、0.5ml、lmk1.5ml、2mk3mk5mklOmk定容至25ml,加入0.5ml的10%抗坏血酸，摇匀，30s后加入1ml钳酸盐溶液充分混匀，显色15min,以超纯水作参比，在700nm比色。用磷浓度与比色值作标准曲线。B. 样品测定称取0.5g沉积物干样（过100目筛）8份，置于100ml离心管中,加入0.02mol/lkcl溶液50ml,放入恒温振荡器中振荡（25摄氏度，200r/min）每隔一定时间（0.5,1.5,3

16、,5,7,12,18,24小时）取出离心管在5000r/min条件下离心5min,取上清液过0.45um滤膜抽滤得滤液取适量滤液到25ml比色管中，用蒸馆I水定容到25ml,加入0.5mll0%抗坏血酸，摇匀，30s后加入lml酸盐溶液充分混匀，显色15min,以超纯水作参比，在700nm比色分别将释放时间和对应磷释放量带入动力学方程，计算动力学参数，绘制动力学方程氨氮所需试剂纳氏试剂：16gNA0H,溶于50ml水中，充分冷却到室温，另称取7g碘化钾，10名碘化汞溶于水，然后将此溶液在搅拌卞徐徐注入NAOH溶液中，用水棉释至100ml储于聚乙烯瓶中，密塞保存。酒石酸钾钠溶液：50g酒石酸钾钠

17、溶于100ml水中，加热煮沸除去氨，放冷定容到100ml钱标准储备溶液：取3.8190g经100摄氏度干燥过的优级纯氯化技溶于水中，定容至1000ml（每亳升此溶液含lg氨氮）钱标准使用溶液：5ml®标准储备液，定容至500ml（每亳升含O.Olmg氨）0.02mol/IKCL溶液操作步骤（1）NH4+N标线绘制7支50ml比色管，分别加入0、0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00ml®标准使用液,用水定容至50ml。加入lml酒石酸钾钠,1.5ml纳氏试剂,混匀。放置lOmin,以超纯水做参比，在420nm测吸光度，由测得的吸光度减去零浓度空白吸光度后

18、，得到校正吸光度，绘制以氨氮含量对校正吸光度的标准曲线。（2）样品测定称取0.5g沉积物干样（过100目筛）8份，置于100ml离心管中,加入0.02mol/lkcl溶液50ml,放入恒温振荡器中振荡（25摄氏度，200r/min）每隔一定时间（5,10,30,60,90,120,180,300min）取出离心管在5000r/min条件下离心15min,取上清液过0.45um滤膜抽滤得滤液取适量滤液到50ml比色管中，用蒸懈水定容到50ml,加入1ml酒石酸钾钠，1.5ml纳氏试剂，摇匀，放置lOmin,以超纯水作参比,在420nm测吸光度分别将释放时间和对应氨氮释放量带入动力学方程，计算动力

19、学参数，绘制动力学方程。注意要点减少实验误差，沉积物干样要充分混匀，采用四分法随机取样实验过程中，释放过程未达到平衡，适当増加释放时间点，延长取样时间，到平衡为止实验根据沉积物样品的特征适当调节释放时间，样品含量过低释放不明显，前期加密释放时间点，含量过高平衡时间长，延长释放时间点结果计算氮磷含量水样含量(mg/l)=cxn/Vc标准曲线得到的氮磷的质量V是水样体积n为分取倍数9.2沉积物氮磷吸附热力学研究方法方法原理：吸附量是吸附平衡时单位质量吸附质上所吸附的吸附质的质量。研究在一定时间内沉积物对不同氮磷浓度的弱盐溶液氮磷的吸附量，通过吸附平衡线计算沉积物氮磷吸附参数，表征沉积物对氮磷的吸附

20、特征。在一定体积和一定浓度的吸附质溶液中，投加一定量的吸附剂，搅拌混合，直至吸附平衡(测定溶液中吸附质的剩余浓度稳定不变时)为止，此时：Q=V(Co-Ce)/mQ为吸附量V溶液体枳CoCe为吸附质的初始浓度和平衡浓度m吸附剂的投加量需要的设备与实验条件分析天平，精度O.OOOlg紫外可见分光光度计离心机恒温振荡器所需试剂和操作步骤磷所需试剂10%抗坏血酸：10g抗坏血酸用水溶解定容100ml到棕色试剂瓶低温保存，使用时颜色变黄要重配钳酸盐溶液：13g于100E水中。0,35g酒石酸怫氧钾100ml水中。不断搅拌，将钳酸钱溶液徐徐加到300ml(l+l)硫酸中，+酒石酸铺氧钾溶液，混合均匀，棕色

21、瓶中4摄氏度保存，至少保存2个月磷酸盐储备液：优级纯磷酸二氢钾到110摄氏度干燥2h,在干燥瓶中放冷，称取0.2197g,溶解到100ml容量瓶中，+(1+1)硫酸5ml用水桶释到标线磷酸盐标准溶液:取10ml磷酸盐储备液用水定容至250ml,每亳升此溶液含2ug磷，现配先用操作步骤标准曲线绘制取25ml比色管7支,分别吸取磷酸盐标准液0、0.5ml、lmk1.5ml、2ml、3ml、5mklOmk定容至25ml,加入0.5ml的10%抗坏血酸，摇匀，30s后加入1ml钳酸盐溶液充分混匀，显色15min,以超纯水作参比，在700nm比色。用磷浓度与比色值作标准曲线。(2)样品测定实验分别在两个

22、磷浓度范围条件下进行，高磷浓度范闱为0-15mg/ml(分别设置为0,0.5,1.0,2.0,5.0,8.0,15.Omg/1)低磷浓度范围0-0.20mg/ml(分别设置为0,0.01,0.02,0.05,0.08,0.10,0.15,0.20mg/l)称取沉积物干样0.5g到100ml离心管中，分别加入50ml不同浓度系别的KH2PO4溶液，在25摄氏度黑暗坏境下振荡24小时到吸收平衡取出离心管，在500r/min下离心15min,取上清液由0.45um滤膜抽滤得滤液,测定SRP浓度取适量滤液到25ml比色管中,用蒸馆水定容到25ml,加入0.5mll0%抗坏血酸，摇匀，30s后加入lml

23、钳酸盐溶液充分混匀，显色15min,以超纯水作参比，在700nm比色氨氮所需试剂纳氏试剂：16gNA0H,溶于50ml水中，充分冷却到室温，另称取7g碘化钾，10名碘化汞溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入NAOH溶液中，用水桥释至100ml储于聚乙烯瓶中，密塞保存。酒石酸钾钠溶液：50g酒石酸钾钠溶于100ml水中，加热煮沸除去氨，放冷定容到100ml钱标准储备溶液：取3.8190g经100摄氏度干燥过的优级纯氯化钱溶于水中，定容至1000ml(每亳升此溶液含lg氨氮)钱标准使用溶液：5ml钱标准储备液，定容至500ml(每亳升含0.Olmg氨)操作步骤(1) NH4+N标线绘制7支50ml

24、比色管，分别加入0、0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.00ml®标准使用液，用水定容至50mlo加入lml酒石酸钾钠，1.5ml纳氏试剂，混匀。放置lOmin,以超纯水做参比，在420nm测吸光度，由测得的吸光度减去零浓度空白吸光度后，得到校正吸光度，绘制以氨氮含量对校正吸光度的标准曲线。(2) 样品测定实验分别在两个氮浓度范围条件下进行，高氮浓度范I制为0-120mg/ml(分别设置为0,5.0,10.0,20.0,60.0,80.0,120.Omg/1)低氮浓度范围0-5.Omg/ml(分别设置为0,0.1,0.4,0.8,1.2,2.0,3.0,5.Omg/

25、1)称取沉积物干样0.5g到100ml离心管中，分别加入50ml不同浓度系别的NH4CL溶液，在25摄氏度黑暗坏境下振荡3小时到吸附平衡取出离心管，在500r/min卜离心15min,取上清液由0.45um滤膜抽滤得滤液，测定氨氮浓度取适量滤液到50ml比色管中，用蒸馆水定容到50ml,加入lml酒石酸钾钠,1.5ml纳氏试剂，混匀，放置lOmin,以超纯水作参比，在420nm测吸光度注意要点减少实验误差，沉积物干样要充分混匀，采用四分法随机取样不同系列的氮磷盐溶液要现用现配人部分样品24h达到吸附平衡，个别沉积物吸附平衡时间存在差异，实验中振荡时间不同,应做预实验确定吸附平衡时间低浓度吸附实

26、验中可能出现负吸附现彖。在实验中应做平行样结果计算氮磷含量水样含量(mg/1)二cxn/Vc标准曲线得到的氮磷的质量V是水样体枳n为分取倍数根据起始浓度和平衡浓度之差，扣除实验空白，计算沉积物吸附磷酸盐吸附量，并利用回归法计算吸附/解吸平衡浓度Ce/Q二Ce/Qmax+Kx1/Qmax9.5沉积物氮磷释放通量研究方法：原位法方法原理在研究区域内I韦I起一定面积的水体和沉积物，进行I制格实验。用搅拌器保证试验区内水体均匀，通过特定的采样口进行采样，测定分析水体中营养盐随时间变化的情况，从而计算出沉积物-水界面营养盐交换通量根据fick第一扩散定律设备和实验条件紫外可见分光光度计离心机柱状样采样机

27、分层采水器便携式多惨仪(或便携式溶氧仪，便携式PH计，便携式Eh计)原位I韦I格PVC实验柱管三根(1000mmX200mm)烘箱所需试剂和操作步骤磷所需试剂10$抗坏血酸：10g抗坏血酸用水溶解定容100ml到棕色试剂瓶低温保存，使用时颜色变黄要重配钳酸盐溶液：13g于100ml水中。0,35g酒石酸铢氧钾100ml水中。不断搅拌，将钳酸技溶液徐徐加到300ml(1+1)硫酸中，+酒石酸怫氧钾溶液，混合均匀，棕色瓶中4摄氏度保存，至少保存2个月0.02mol/lkcl溶液磷酸盐储备液：优级纯磷酸二氢钾到110摄氏度干燥2h,在干燥瓶中放冷，称取0.2197g,溶解到100ml容量瓶中，+（1

28、+1）硫酸5ml用水桶释到标线磷酸盐标准溶液:取10ml磷酸盐储备液用水定容至250ml,每亳升此溶液含2ug磷，现配先用操作步骤标准曲线绘制取25ml比色管7支，分别吸取磷酸盐标准液0、0.5ml、1ml、1.5ml、2nd、3ml、5ml、10ml>定容至25ml,加入0.5ml的10%抗坏血酸，摇匀，30s后加入lml钳酸盐溶液充分混匀，显色15min,以超纯水作参比，在700nm比色。用磷浓度与比色值作标准曲线。（2）样品测定取样：用沉积物柱状样采样器采集30cm左右沉积物住壮样，在现场按照2cm的间隔分层置于塑料袋中，4摄氏度暗处保存运回实验室立即作进一步处理，同时取分层上覆水

29、样测定沉积物的土粒密度（比重瓶法）沉积物容重测定：将坏刀托放在一直重量的环刀杯上，环刀内壁稍微擦上凡士林，将环刀刃口向下垂直压入沉积物中，直至环刀桶中充满沉积物为止。用修土刀切开周I制的土样，取出已充满沉积物的环刀，细心削平环刀两端多余的沉积物，并擦净环刀外面的沉积物。把坏刀两端立即加盖，以免水分蒸发。随机称重。取出坏刀内的沉积物，测定土壤含水量。间隙水:将新鲜沉积物装入100ml的离心管在5000r/min条件下离心lOmin,获得间隙水取适量的间隙水和上覆水到25ml比色管中，用蒸馆I水定容25ml,加入0.5ml的10%抗坏血酸，摇匀，30s后加入lml钳酸盐溶液充分混匀，显色15min,以超纯水作参比，在700nm比色。氨氮所需试剂纳氏试剂：16gNA0H,溶于50ml水中，充分冷却到室温，另称取7g碘化钾，10名碘化汞溶于水，然后将此溶液在搅