Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告

1、南方医科支学生物化学实验报告姓 名:学 号:专业年级:组 另生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名 李某某批改日期 2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。二、实验原理Folin-酚反应是利用蛋白质分子中

2、酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷鸨 酸-磷铝酸）起蓝色反应。为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与 酚试剂反应。1、双缩月尿反应：在碱性溶液中，双缩IK（H2NOCNHCONH2）能与Cu2+作用，形成紫 色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩月尿反应。由于蛋白质分子中含有与双缩月尿结构 相似的多个肽键，因此有双缩月尿反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜 试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物。2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下， 可使酚试剂中的磷铝酸化合物还原成蓝色（生成铝蓝和鸨蓝化合物）。在一定

3、浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量 三、材料与方法：以流程图示意1、材料： 样品：健康人的血清（稀释300倍） 试剂：牛血清蛋白标准液（200仙g/ml、碱性的硫酸铜溶液、蒸储水、Folin-酚试剂 仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头 取6支试管编号16,按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min试剂（ml）123456牛血清蛋白标准液-0.20.40.60.8-样品液（稀释300倍）-0.5蒸储水1.00.80.60

4、.40.20.5碱性硫酸铜溶液2.02.02.02.02.02.0蛋白质的含量（pg/mJ04080120160待测表格1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤 往6支试管中分别加入Folin-酚试齐0.20ml,在2s内立即混匀。40c水浴加热 10min后，冷却至室温。 用V-1100型分光光度计以500nm波长比色，用1号管做空白，测量各管吸光 度值并记录，每管测量3次。 数据处理，绘制标准曲线，计算实验结果。四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推 论，并得出结论。1、结果实验现象：1）加入蒸储水、蛋白样品和碱性硫酸铜溶液后，溶液均呈无色。2）加入Foli

5、n-酚试剂后，溶液均呈黄色图1水浴前各试管溶液颜色3）水浴后，1号试管溶液呈无色。2号试管到5号试管溶液呈蓝色，且颜色逐渐加深。6号试管溶液颜色介于4号与5号之间，更接近于5号。图2水浴后各试管溶液颜色实验数据记录与分析各管A值测定次数 2345610.0500.0880.1280.1440.14220.0490.0850.1250.1440.14230.0470.0840.1240.1430.142各管平均值0.0490.0860.1260.1440.142表格2 500nm波长吸光度值记录12345C ( 11 g/mJ04080120160A （吸光度）00.0490.0860.1260

6、.144表格3绘制标准曲线数据表标准曲线4 21 18 61 1-1 8 6 4 2 060 0 0 0i0a(悭芸等)<O18O128D6040ml8/口标准曲线图 实验结果计算：由标准曲线图可得，标准曲线方程为y=0.001x。由实验测得样品管（6号试管）的吸光度为0.142,即y6=0.142,代入标准曲线方程中可求得C6' =0.142/0.001=142仙g/ml。即样品管中的蛋白质浓度为142pg/ml。由于血清被稀释 了 300倍，在实验中根据化学定量原则 再稀释2倍。因此，健康人血清中蛋白质浓度C6=142*300*2=85200ug/ml=85.200g/L。最

7、终通过实验测得健康人血清中蛋白质浓度为 85.200g/L。2、分析 最终实验结果超出正常范围（正常人血清蛋白浓度范围为6080g/L）。可能的 原因有：1）酚类、柠檬酸、硫酸俊、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有 干扰作用，导致蛋2）实验操作不当 。3）从标准曲线图来看，前四个点基本在一条直线上，第五个点偏差较大。由此猜测第五支试管的吸光度误差较大，导致实验结果偏大。4）第五、六支试管与前四支试管所使用的分光光度计不是同一台，而分光光度计是一种精密仪器，更换仪器 会导致吸光度测量上有较大误差。5） 显色时间控制存在误差，各个样品的比色时间也无法完全一致。6） 取用蛋白质溶液可能不完全均

8、匀，对结果造成影响。7） 试管可能未完全干燥，使标准液浓度不准确。 由标准曲线图可知，在一定的浓度范围内，吸光度值和蛋白质的浓度呈现正比例的关系。即在一定的范围内，蛋白质浓度越高，蓝色越深，吸光度值越大。通过这种正比例的关系，可以采用比色分析法，即通过测量待测液的吸光度值来获得蛋白质的浓度 。Folin-酚试剂法的优点有：1）灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020倍，双缩 脲法灵敏100 倍。2）操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而试管中加入碱性硫酸铜试剂后导致溶液 呈碱性，Folin-酚试剂不稳定。因此，Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，应 该立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸- 磷钨酸试剂被破坏之前。 从正常人血清蛋白浓度范围来看，样品管中的蛋白质浓度大约在100133.33仙g/ml因此颜色深度大概在三号试管与五号试管之间。 本次实验采用浓度梯度法，反应体系设置了一支空白管，四支标准管（蛋白质浓度以40仙g/ml为梯度递增），每支试管测量三次取平均值。由此得到的五个数据能减少标准曲线图的误差。 因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，如果没有严格控制时间，就会对最后吸光度值得测量产生误差。因此各项操作必须精确控制时间。 部分物质会对双缩脲反