细胞融合与单克隆抗体学习教案

1、会计学1细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体(kngt)第一页，共43页。第2页/共43页第二页，共43页。第3页/共43页第三页，共43页。v 70 70年代年代,(,(华裔加籍华裔加籍) )高国楠高国楠 PEG PEG促植物促植物(zhw)(zhw)原生原生v 质体的融合质体的融合v 80 80年代年代(nindi)(nindi)，电融合，电融合第4页/共43页第四页，共43页。现代(xindi)植物细胞融合的开始1978年（德）梅歇尔斯“potomo”第5页/共43页第五页，共43页。“Pomoto ”第6页/共43页第六页，共43页。第7页/共43页第七页，共43页。动物(dngw

2、)细胞融合 动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及(yj)创造新细胞株的有效途径。第8页/共43页第八页，共43页。肿瘤细胞肿瘤细胞(xbo)与树与树突状细胞突状细胞(xbo)的融的融合合第9页/共43页第九页，共43页。人纤维肉瘤(ruli)细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合1978年年(瑞士瑞士(ru sh)埃勒门斯埃勒门斯 (美国美国(mi u)柯柯路斯路斯第10页/共43页第十页，共43页。第11页/共43页第十一页，共43页。物理法物理法:电场刺激电场刺激(cj) 激光激光 显微操作显微操作 化学法化学法:聚乙二醇聚乙二醇(PEG)结合高结合高pH、 高钙离子法高钙离子法

3、生物法生物法:仙台病毒仙台病毒第12页/共43页第十二页，共43页。来来 源源前处理前处理融合方法融合方法主要应用主要应用动物细胞动物细胞不需不需仙台病毒、仙台病毒、PEGPEG、电融合电融合生产单克隆生产单克隆抗体抗体植物细胞植物细胞脱壁脱壁PEGPEG、电融合、电融合创造植物新创造植物新品种品种微生物细胞微生物细胞脱壁脱壁PEGPEG高产优质新高产优质新菌种菌种第13页/共43页第十三页，共43页。也称日本血凝病毒也称日本血凝病毒(bngd)HVJ(bngd)HVJ，属粘病毒，属粘病毒(bngd)(bngd)副流感类群，是副流感类群，是RNARNA病毒病毒(bngd)(bngd)，多型颗粒

4、状，易在小鼠中蔓延。多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。 第14页/共43页第十四页，共43页。仙台病毒诱导仙台病毒诱导(yudo)第15页/共43页第十五页，共43页。仙台病毒诱导仙台病毒诱导(yudo)第16页/共43页第十六页，共43页。仙台病毒诱导仙台病毒诱导(yudo)第17页/共43页第十七页，共43页。PEG聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol) 商品(shngpn)名：卡波蜡(carbowax)多聚化合物，分子式H(OCH2CH2)nOH实验室用实验室用PEG平均分子量在平均分子量在20020,000一般一般(ybn)：1,000固体固体常用分子量：常用分子量：40

5、006000PEG诱导诱导第18页/共43页第十八页，共43页。？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生(fshng) 变化变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋 白质颗粒聚集白质颗粒聚集(jj)及膜脂分子随之发生及膜脂分子随之发生重排之重排之 故。故。 ？PEG诱导诱导第19页/共43页第十九页，共43页。洗脱，导致电荷平衡失调并洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合而形成具有共同质膜的融合体。体。PEG诱导诱

6、导(yudo)第20页/共43页第二十页，共43页。PEG诱导诱导(yudo)悬浮法：将细胞悬于悬浮法：将细胞悬于40405050的的PEG4000PEG4000进行进行(jnxng)(jnxng) 溶，处理溶，处理1 12 2分钟为宜。分钟为宜。离心法离心法：先将细胞混合物悬于先将细胞混合物悬于30304040的的 PEG4000PEG4000，再离心进行融合，则可适，再离心进行融合，则可适 当延长融合时间，以当延长融合时间，以5 58 8分钟为宜。分钟为宜。 第21页/共43页第二十一页，共43页。l 辅以辅以515的的DMSO或在融合前用或在融合前用 l PHA处理处理(chl)一下，效

7、果更好。一下，效果更好。PEG诱导诱导第22页/共43页第二十二页，共43页。PEG诱导诱导(yudo)PEG融合法缺点 对细胞有毒性第23页/共43页第二十三页，共43页。PEG诱导诱导(yudo)第24页/共43页第二十四页，共43页。电融合诱导电融合诱导(yudo)机制机制(jzh)在直流电脉冲的诱导下, 原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化, 使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭合成完整的细胞融合体第25页/共43页第二十五页，共43页。电融合诱导电融合诱导(yudo)第26页/共43页第二十六页，共43页。u融合融合(rngh)效率高，可达效率高，可达508

8、0u产生产生(chnshng)杂交细胞的频率高，是杂交细胞的频率高，是PEG法法的的100倍。倍。u u操作简便、稳定，但需设备。操作简便、稳定，但需设备。u对细胞无毒害作用。对细胞无毒害作用。u可在显微镜下观察操作。可在显微镜下观察操作。电融合诱导电融合诱导第27页/共43页第二十七页，共43页。视野内全部细胞视野内全部细胞(xbo)的细胞的细胞(xbo)核总数核总数 100融合率融合率=第28页/共43页第二十八页，共43页。化化,8.从细胞团从细胞团,愈伤组织到最后愈伤组织到最后成株成株第29页/共43页第二十九页，共43页。组织(zzh)的获得组织的消化组织的消化诱导细胞融合形成杂种细

9、胞 筛选，培养第30页/共43页第三十页，共43页。第31页/共43页第三十一页，共43页。比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合的原理细胞融合的原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法去处细胞壁后诱去处细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（显微操作、物理（显微操作、电融合）电融合）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株

10、制备单克隆抗体制备单克隆抗体第32页/共43页第三十二页，共43页。 (1) 亲本(qn bn)细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则 者较易融合；表面光滑者较难融合。(2) 细胞种类不同，融合效果不同，如腹水(fshu)癌及 株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞 几乎不融合。 (3) 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙 台病毒诱导欧利希氏腹水癌细胞融合时，于 37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量 呈正比。但在34 振摇则融合率下降。在 37时不振摇则几乎不融合。 影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素第33页/共43页第三十三页，共43页。(5)有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细

11、胞蛋 白质亦发生变化。实验表明(biomng)Sr2+、Ba2+、Mg2+、 Mn2+等离子可代替Ca2+但有效浓度较Ca2+大 的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L(6)最适合(shh)的pH为7478之间，在此范围之外， 融合率均较低。影响细胞融合的因素影响细胞融合的因素第34页/共43页第三十四页，共43页。第35页/共43页第三十五页，共43页。第36页/共43页第三十六页，共43页。异核体异核体(heterokaryon）多核体（多核体（polykaryon）异胞质体异胞质体(heterocybrid)第37页/共43页第三十七页，共43页。同源细胞的融合体。由于是同源细同源细胞的融合体。由于是同源细