脓汁与粪便标本中病原菌的检测-1

1、实验分组实验分组v俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台左右医学微生物学实验医学微生物学实验周莹南方医科大学微生物学系医学微生物学实验医学微生物学实验 Medical Microbiology PracticumMedical Microbiology Practicumv医学微生物学实验课是一门操作技能很强的课程。v实验课教学的主要目标是使学生了解医学微生物

2、学主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，树立牢固的无菌观念。v更重要的是培养学生自学能力、科学思维能力、动手能力和表达能力。 微生物学实验室规则微生物学实验室规则 Lab Safety RegulationLab Safety Regulation v进入实验室必须穿白大衣（离开时反折进入实验室必须穿白大衣（离开时反折) )，戴帽子。，戴帽子。v书本、文具放在抽屉里。书本、文具放在抽屉里。v实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头脸等部位。要用手抚摸头脸等部位。v凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指

3、定地点等待灭菌处凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处理，不得随便乱放或用水冲洗。理，不得随便乱放或用水冲洗。v一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。v离开实验室前离开实验室前, ,必须洗手。怀疑污染应及时用必须洗手。怀疑污染应及时用11新洁而灭泡手。新洁而灭泡手。v每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖把拖地以后每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖把拖地以后再扫地，实验室用紫外线灯照射再扫地，实验室用紫外线灯照射1 1小时。小时。实验室器材介绍实验室器材介绍常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序

4、：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1列放置接种针列放置接种针, ,第第2 2列放置列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。普通冰箱普通冰箱(3(3颗星颗星* * * *) )冷藏室冷藏室( (上柜）：上柜）：温度温度4 488，保存培养基、细菌，保存培养基、细菌培养物、常用菌种培养物、常用菌种和抗菌素纸片和抗菌素纸片等等。冷冻室（下柜）：冷冻室（下柜）：温度温度1818，保存诊断血清、血，保存诊

5、断血清、血浆，长期保藏的菌种和抗菌素纸浆，长期保藏的菌种和抗菌素纸片。片。 卫生工具：卫生工具：扫帚扫帚,拖把拖把,撮箕撮箕,垃圾筐垃圾筐,放在冰箱放在冰箱和水池之间。和水池之间。隔水式电热恒温培养箱：隔水式电热恒温培养箱：35353737，一般细菌培养时间为一般细菌培养时间为18182424小时。小时。 奥林巴斯奥林巴斯 CX21CX21型型 生物显微镜生物显微镜（实验柜内，实验柜内，每人一台）每人一台）注意：只能横放，不得竖放。注意：只能横放，不得竖放。革兰染色瓶革兰染色瓶染色架染色架石蜡油石蜡油拭镜纸拭镜纸吸水纸吸水纸乙醇乙醚乙醇乙醚微生物学器材柜微生物学器材柜-1-1（西侧边台中段）（

6、西侧边台中段）电炉电炉微生物学器材柜微生物学器材柜-2-2（东侧边台中段）（东侧边台中段）酒精棉球酒精棉球碘酒棉球碘酒棉球镊子镊子电炉、石棉网电炉、石棉网手套手套 1500W 1500W电炉电炉安全警告安全警告1.1.电源插塞与电炉插孔接触良好电源插塞与电炉插孔接触良好插头插入插座。插头插入插座。2.2.如果培养基暴沸溢出，流入电炉；必须立即如果培养基暴沸溢出，流入电炉；必须立即切断切断电源、拔除插头；电源、拔除插头；以免以免触电，危及生命！触电，危及生命！东西两侧边台各一个电炉，每个电炉东西两侧边台各一个电炉，每个电炉可同时放置可同时放置4 4个个300ml300ml锥形瓶进行锥形瓶进行加热

7、加热。蒸馏水：蒸馏水：配制培养基。11新洁而灭：新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手35分钟。消毒液：消毒液：擦拭实验台台面。玻片缸：玻片缸：浸泡用过的载玻片。器材柜（上层）器材柜（上层）量筒量筒锥形瓶锥形瓶器材柜（中层）器材柜（中层）砝码砝码天平天平干粉培养基干粉培养基称量纸称量纸 牛皮纸牛皮纸硫酸纸硫酸纸 橡皮筋橡皮筋药勺药勺 厘米尺厘米尺砂轮砂轮 创可贴创可贴 洗耳球洗耳球洗牙球洗牙球 小吸球小吸球脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程实验流程(6(6次课次课1212学时）：学时）：v培养基的制备培养基的制备 v细菌的分离培养细菌的分离培养 v细菌的纯培养细菌的纯培养 v细菌的形态学检查细菌的形

8、态学检查 v细菌的生化试验等细菌的生化试验等 v结果观察、分析、总结结果观察、分析、总结撰写实验论文撰写实验论文常见病原性球菌的检查程序常见病原性球菌的检查程序P47P47： 直接涂片、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检脓汁、痰、咽部分泌物脓汁、痰、咽部分泌物 观察菌落性状、溶血性、色素观察菌落性状、溶血性、色素 血琼脂平板培养血琼脂平板培养 涂片染色镜检涂片染色镜检 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 生化反应生化反应 纯培养纯培养 动物实验动物实验 药敏实验药敏实验血液、穿刺液血液、穿刺液 肉汤增菌培养肉汤增菌培养 培养液涂片染色境检培养液涂片染色境检 常见肠道致病菌的检查程序常见肠道致病菌的检

9、查程序P48P48：粪便粪便 SS SS琼脂、伊红美蓝平板培养琼脂、伊红美蓝平板培养 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 血清学鉴定血清学鉴定 血、骨髓血、骨髓 增菌培养增菌培养 双糖铁培养基双糖铁培养基 染色镜检染色镜检 生化反应生化反应 脓汁和粪便标本中病原菌的检测(一)培养基的制备P2消毒与灭菌P5细菌的人工培养无菌技术（录像）摆斜面，倾注平板。培养基的制备 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分装分装(ml)(ml)备注（备注（4040

10、人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.411.43003004 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.92.975753 35 51515支，中试管，斜面支，中试管，斜面5 57 7营养肉汤营养肉汤1.11.150501 13 31515支，小试管，液体支，小试管，液体8 81010半固体琼脂半固体琼脂1.51.550503 33 31515支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培养基的制备 Preparation ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养

11、基称量称量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分装分装(ml)(ml)备注（备注（3636人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.411.43003003 3瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.72.770703 35 51414支，中试管，斜面支，中试管，斜面6 67 7营养肉汤营养肉汤1.31.360601 13 32020支，小试管，液体支，小试管，液体8 81010半固体琼脂半固体琼脂1.31.345453 33 31414支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！培养基的制备 Prepara

12、tion ofPreparation of Culture MediaCulture Media组号组号培养基培养基称量称量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分装分装(ml)(ml)备注（备注（3232人份）人份）1 1营养琼脂营养琼脂11.411.43003003 3瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4营养琼脂营养琼脂2.32.360603 35 51212支，中试管，斜面支，中试管，斜面6 6、7 7营养肉汤营养肉汤1.21.255551 13 31818支，小试管，液体支，小试管，液体8 8、9 9半固体琼脂半固体琼脂1.61.655553

13、33 31818支，小试管，高层支，小试管，高层公共培基，勿作标记！公共培基，勿作标记！ 培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸1 1次，含琼脂的次，含琼脂的培养基煮沸培养基煮沸3 3次次( (煮至煮至刚刚冒泡刚刚冒泡, ,立即放置台面，半分钟后再煮立即放置台面，半分钟后再煮) )。加热时加热时,常摇动。常摇动。沸腾时，不能摇动！沸腾时，不能摇动！用洗耳球和刻度吸管分装培养基。用洗耳球和刻度吸管分装培养基。棉塞棉塞1/21/2塞入试管口内，松紧合适。塞入试管口内，松紧合适。放试管筐内，罩上硫酸纸放试管筐内，罩上硫酸纸和牛皮纸，扎好橡皮筋。和牛皮

14、纸，扎好橡皮筋。培养基趁热分装培养基趁热分装培养基装筐待灭菌培养基装筐待灭菌量筒量筒锥形瓶锥形瓶砝码砝码干粉培养基干粉培养基试管筐试管筐天平天平边台柜子内器材边台柜子内器材边台抽屉内器材边台抽屉内器材试管（棉塞），刻度吸管，洗耳试管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，称量纸，药勺，硫酸纸、牛球，称量纸，药勺，硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋皮纸、橡皮筋, ,厘米尺。厘米尺。 称量纸置于左盘，游码称量纸置于左盘，游码移至标尺左端移至标尺左端“0”0”点位置点位置上，指针应对准中线，取得上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。整螺母旋动调节平衡。 秤物时秤物时“物

15、左码右物左码右”，物品放在左盘上，砝码放物品放在左盘上，砝码放在右盘，尽可能放在秤盘在右盘，尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清中心。天平保持干燥、清洁。洁。每组只用一张称量纸！称量皿扣除皮重！每组只用一张称量纸！称量皿扣除皮重！培养基制备程序 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装集中放在试管筐内，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好 放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）。 请在 30分钟内完成。细菌培养基细菌培养基 Culture MediaCulture Media 培养基是用人工的方法，将多种营养物质，根据各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。它的主要成分是蛋白胨、牛

16、肉膏、氯化钠和水，pH7.47.6。v培养基制备的一般程序：培养基制备的一般程序： 调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存。 干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定 保存。v培养基的制备原则：培养基的制备原则： (1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必须灭菌。v培养基的种类（按物理性状分类）培养基的种类（按物理性状分类）液体培养基:不含凝固剂(琼脂),用于增菌，纯培养,保种。固体培养基:含12琼脂，用于分离培养,纯培养,保种。半固体培基:含0.30.5琼脂，用于动力检测,保种。营养肉汤营养肉汤 nutrient brothnutrient broth琼脂斜面琼脂斜面 agar sl

17、ant agar slant 琼脂高层琼脂高层 agar deepagar deepv培养基的种类（按用途分类）培养基的种类（按用途分类）P P3 3基础培养基基础培养基: :含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分，可作为一些特殊培养基的基础成分，如普通平板。营养培养基营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长，如血平板。增菌培养基：增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。选择培养基：选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。鉴别培养基：鉴别培养基：利用细菌分解能

18、力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用来试验细菌的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。厌氧培养基：厌氧培养基：氧化还原电势低，表面用凡士林、石蜡封住，与空气隔绝，成为无氧环境，如庖肉培养基。培养基的灭菌培养基的灭菌 在冷空气完全排尽的情况下，蒸汽压103.43 kPa ,温度可达到121.3 ,维持1530分钟，可以杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。v基础培养基：121高压蒸汽灭菌1530分钟。v含糖培养基：115灭菌15分钟。v鸡蛋、牛奶培养基:75100间歇灭菌3次(1天1次)。v不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌（EK型蔡氏滤器、 G5或G6玻璃滤器、0.45um或0.

19、22um微孔滤膜） 含琼脂的培养基灭菌以后，冷却含琼脂的培养基灭菌以后，冷却50506060（温度越高，冷凝水（温度越高，冷凝水越多，越易污染越多，越易污染 ），以无菌操作，倾注平皿），以无菌操作，倾注平皿10ml10ml（直径（直径7 7厘米平厘米平皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。 平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？防止平板水分蒸发丢失。防止平板水分蒸发丢失。防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。琼

20、脂平板琼脂平板 agar plateagar plate 含琼脂的培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过含琼脂的培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过试管长度的试管长度的2/32/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。 斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。 斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌种保藏。种保藏。琼脂斜面琼脂斜面 agar slantagar slant怎样检查培养基是否合格?无菌试验：将待检培养基置于3537培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。效果试验：将已知的标准参

21、考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。细菌生长繁殖的方式和速度细菌生长繁殖的方式和速度v细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。v繁殖速度：多数2030分钟繁殖1代，结核杆菌1820小时繁殖一代。v细菌生长繁殖曲线细菌的生长曲线细菌的生长曲线细菌数目的对数细菌数目的对数培养时间培养时间（小时）（小时）5 10 15 20 25 30 6.06.57.07.58.08.59.0活菌数活菌数总菌数总菌数迟缓期迟缓期对数生长期对数生长期稳定期稳定期衰退期衰退期细菌生长曲线意义细菌生长曲线意义v迟缓期：一般14h，细菌代谢活跃，但不繁殖。v对数期：维持48

22、h，细菌快速繁殖，数目呈几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性最典型、对抗生素最敏感。细菌鉴定选用此期为佳。v稳定期： 通常维持10h，活菌数和死菌数几乎相等，代谢产物形成较多。v衰亡期：培养18 24 h以后，代谢逐渐停滞,死菌数超过活菌数。常用玻璃器材的处理程序（示教）常用玻璃器材的处理程序（示教）v新购置的玻璃器材:2盐酸浸泡过夜中和游离碱流水冲洗15次晾干包装灭菌。 v无污染器皿:洗涤剂洗刷。v病原菌污染的器材（消毒、灭菌后再处理！）：试管、吸管和平皿：高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净。吸管：3来苏儿或5%石碳酸浸泡过夜。载玻片：3来苏儿或5%石碳酸浸泡过夜 肥皂水煮沸10min 流水冲洗15次晾干待用。玻璃器材洗干净的标准玻璃器材洗干净的标准v1.洗涤时观察:洗后的玻璃器材附着在内壁上的水不是个别水珠水珠,而是一层极薄的水膜水膜。v2.干燥后观察:对着光亮处观看玻璃器材,非常透明, 内外壁上不出现大片发白或白点,也无微